Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens
Summary
Paraffine-ingebedde specimens formaline-vaste vormen een waardevolle bron van moleculaire biomarkers voor ziekten bij de mens. Hier presenteren we een laboratorium gebaseerde cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol, in eerste instantie ontworpen met vers bevroren RNA, en geoptimaliseerd voor de analyse van gearchiveerde microRNAs uit weefsels tot 35 jaar opgeslagen.
Abstract
– Gearchiveerd, klinisch ingedeeld formaline-vaste kunnen paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels voorzien nucleïnezuren retrospectieve moleculaire studies van de ontwikkeling van kanker. Met behulp van niet-invasieve of vooraf kwaadaardige laesies van patiënten die later het ontwikkelen van invasieve ziekte, kunnen gen expressie analyses helpen identificeren van vroege moleculaire veranderingen die naar cancer risk predisponeren. Het is goed beschreven dat nucleïnezuren verhaald FFPE weefsels ernstige fysieke schade en chemische wijzigingen, die bemoeilijken hun analyse en in het algemeen vereist aangepast tests hebben ondergaan. MicroRNAs (miRNAs), maar die een kleine klasse vertegenwoordigen van RNA-moleculen die slechts tot ~ 18-24 nucleotiden, is aangetoond dat langdurige opslag weerstaan en hebben met succes is geanalyseerd in FFPE monsters. Hier presenteren we een 3′ barcoded complementaire DNA (cDNA) bibliotheek voorbereiding protocol specifiek geoptimaliseerd voor de analyse van kleine RNAs geëxtraheerd uit gearchiveerde weefsels, die onlangs werd aangetoond als robuust en zeer reproduceerbaar, wanneer met behulp van gearchiveerd klinische monsters opgeslagen tot 35 jaar. De voorbereiding van deze bibliotheek is goed aangepast aan de multiplex analyse van gevaar/gedegradeerd materiaal waar RNA samples (maximaal 18) zijn afgebonden met individuele 3′ barcoded adapters en vervolgens samen gebundeld voor verdere enzymatische en biochemische preparaten vóór de analyse. Alle purifications worden uitgevoerd door polyacrylamide gelelektroforese (pagina), waarmee de grootte-specifieke selecties en verrijking van barcoded kleine RNA soorten. Dit cDNA Bibliotheek voorbereiding is goed aangepast aan minuut RNA ingangen, als een pilot polymerase-kettingreactie (PCR) vaststelling van een specifieke versterking cyclus toelaat te produceren optimale hoeveelheden materiaal voor het rangschikken van de volgende generatie (NGS). Deze aanpak is geoptimaliseerd voor het gebruik van aangetaste FFPE RNA uit monsters van maximaal 35 jaar gearchiveerd en biedt zeer reproduceerbaar NGS-gegevens.
Introduction
miRNAs zijn opmerkelijk goed bewaard in formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) exemplaren1,2,3. Vorige werk heeft aangetoond dat de uitdrukking van deze korte regelgevende niet-coderende één gestrande molecules van RNA met succes kan worden geëvalueerd met behulp van totaal RNA van FFPE monsters en relevante gen expressie gegevens in vergelijking met de originele fresh weefsels4,5,6,7,8. In vergelijking met grote messenger RNAs, die hebben aangetoond dat kritisch worden beïnvloed door FFPE weefsel verwerking (formaldehyde, hitte, uitdroging, enz.), endogene RNases, en de leeftijd van de specimens, de geringe omvang van miRNAs (~ 18-24 nucleotiden) verschijnt ze resistent tegen afbraak en veerkrachtig voor langere termijn opgeslagen, ook aangetoond door miRNA expressie studies die beter te presteren dan high-throughput mRNA studies in gearchiveerde exemplaren9te maken. miRNA expressie studies met behulp van gearchiveerde klinische monsters, die meestal in kleinschalige analyses zijn uitgevoerd, hebben aangetoond dat één of multiplexed kwantitatieve PCR-testen, verschillende soorten technologieën van microarray, en meest recent NGS kan worden gebruikt ter beoordeling van de expressie van bewaarde miRNAs na optimalisering van deze testen10,11,12,13,14.
Gezien het feit dat disregulatie van miRNA expressie geassocieerd met de ontwikkeling van een verscheidenheid van menselijke maligniteiten is geweest en dat er potentieel een enorm aanbod van klinisch is geannoteerde gearchiveerde exemplaren, is duidelijk geworden dat deze kleine RNA moleculen vormen een veelbelovende bron van potentiële kanker biomarkers15,16,17,18. Het gebruik van een high-throughput gen expressie technologie zoals NGS heeft het voordeel van een globale beoordeling van alle miRNA afschriften in vergelijking met gerichte technologieën zoals PCR en/of microarrays19. Om deze reden is een geoptimaliseerde, betaalbare en gemakkelijk toepasbare protocol voorbereiding cDNA Bibliotheek van kleine RNAs van oudere gearchiveerde exemplaren voor NGS geoptimaliseerd zodat grootschalige retrospectieve studies20.
Wij eerder vastgestelde een gelijktijdige RNA/DNA-extractie-protocol voor afzonderlijke terugwinning van RNA en DNA uit oudere gearchiveerde exemplaren, die wij beter te presteren dan hedendaagse commerciële kits21gevonden. Met behulp van dit protocol extractie te verkrijgen van totaal RNA van FFPE weefsels gearchiveerd voor langere periode van tijd, wij de voorbereiding van cDNA bibliotheken voor NGS van miRNAs in klinische monsters bewaard tot 35 jaar geoptimaliseerd. Bovendien, in een onlangs gepubliceerde studie waar we bereid cDNA bibliotheken van klinisch geclassificeerde ductaal carcinoma in situ (DCIS) exemplaren, we geïdentificeerd differentially uitgedrukte miRNAs die werden gevalideerd door kwantitatieve PCR, die aangegeven dat specifieke miRNA expressie verandert kan in DCIS laesies van patiënten die de ontwikkeling van kanker van de borst in vergelijking met DCIS laesies van patiënten die geen borstkanker ontwikkelen opgespoord worden.
Gelet op de kosten van commerciële kits voor voorbereiding van kleine RNA-cDNA bibliotheken, het potentieel voor hun stopzetting, evenals het gebruik van/octrooi beschermd reagentia die niet kan worden geoptimaliseerd, we besloten aan te passen een eerder gepubliceerde laboratorium gebaseerde en kit-gratis 3′ barcoded cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol voor NGS van kleine RNAs gearchiveerd in FFPE exemplaren, waardoor gelijktijdige analyse van 1822monsters. Dit protocol biedt een ideale en robuuste stapsgewijze procedure met visuele en technische evaluatie controleposten, die kritisch zijn voor de aanpassing aan FFPE RNA exemplaren waren, en heeft een sterk potentieel voor toepassing naar andere bronnen van gecompromitteerde of moeilijk RNA om materiaal te gebruiken. Van het protocol van het oorspronkelijke toepasbaarheid werd verbeterd door vervanging van radioactief gelabelde grootte markeringen met TL (bvSYBR Gold) aantoonbaar RNA grootte markeringen gebruikt tijdens de selectie van ligaturen bibliotheken op grote polyacrylamide gels. Dit geoptimaliseerd protocol is afhankelijk van de afbinding van 3′ barcoded adapters met 18 afzonderlijke FFPE RNA-modellen, die dan samengevoegd samen te ondergaan adapter afbinding 5′, omgekeerde-transcriptie en een pilot PCR-analyse voor op maat van versterking van de definitieve cDNA bibliotheek voorafgaand aan grootschalige PCR versterking, reiniging, en NGS op een hoge doorvoersnelheid sequencer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een zeer reproduceerbaar en robuuste cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol voor NGS van kleine RNAs gearchiveerd in FFPE RNA specimens is gepresenteerd in dit protocol, dat een aangepaste en geoptimaliseerde versie van de procedure beschreven door Hafner et al. is 22
Alle stappen van dit protocol zijn geoptimaliseerd voor gebruik met oudere gearchiveerde en gecompromitteerde totaal RNA verhaald van FFPE exemplaren. De belangrijkste stap van dit protocol, voor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Thomas Tuschl, hoofd van het laboratorium voor moleculaire biologie van RNA, en ook familieleden van zijn laboratorium voor hun steun en voor het delen van de technologie, ontwikkeld in zijn laboratorium en toegang bieden tot de pijpleiding van de RNAworld. Wij danken ook Dr. Markus Hafner voor zijn protocol voor het delen en het verstrekken van gedetailleerde beschrijvingen over alle biochemische en enzymatische stappen in zijn eerste procedure gebruikt.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
- Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure–DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
- Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
- Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
- Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
- Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
- Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
- Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
- Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
- Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
- Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
- Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
- Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
- Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
- Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
- Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
- Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
- Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
- Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
- Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
- Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
- Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).
