Ретроспективное микроРНК последовательности: Комплементарной ДНК библиотеки подготовка протокол с помощью образцов формалин Исправлена парафин врезанных РНК
Summary
Формалин Исправлена парафин врезанных образцы представляют собой ценный источник молекулярных биомаркеров заболеваний человека. Здесь мы представляем на базе лаборатории cDNA библиотека подготовки протокола, первоначально разработанный с свежий замороженные РНК и оптимизирован для анализа архивных микроРНК из тканей хранится до 35 лет.
Abstract
-Архив, клинически классифицированы формалин Исправлена парафин врезанных тканей (FFPE) может обеспечить нуклеиновые кислоты для ретроспективных молекулярных исследований развития рака. С помощью неинвазивных или предварительно злокачественных поражений от пациентов, которые позже развивать инвазивное заболевание, анализ выражения гена может помочь определить ранние молекулярных изменений, которые предрасполагают к риск рака. Хорошо описал, что нуклеиновые кислоты, оправился от FFPE тканей претерпели серьезный физический ущерб и химические изменения, которые затрудняют их анализ и обычно требует адаптации анализов. МикроРНК (интерферирующим), однако, которые представляют собой небольшой класс молекул РНК, охватывающих только до ~ 18 – 24 нуклеотидов, было показано, чтобы выдерживать длительного хранения и успешно проанализирован в FFPE образцах. Здесь мы представляем 3′ перепутываются взаимодополняющих ДНК — (cDNA кДНК) библиотеки подготовка протокола специально оптимизирована для анализа малых РНК, извлеченные из архивных тканей, который был недавно продемонстрирован быть надежной и высокую воспроизводимость при использовании Архив Клинические образцы хранятся до 35 лет. Эта библиотека подготовка хорошо приспособлены к мультиплекс анализ под угрозой деградации материала где лигируют с отдельными 3′ перепутываются адаптеры и затем объединить вместе для последующего ферментативные и биохимических препаратов образцов РНК (до 18) Перед анализом. Электрофорез геля полиакриламида (страница), которая позволяет размер конкретным критериям и обогащения перепутываются малых РНК видов выполняются все очищения. Эта подготовка кДНК библиотеки хорошо приспособлены к минута РНК входы, как экспериментальный полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет определять конкретные усилители цикла производить оптимальное количество материала для следующего поколения последовательности (НГС). Этот подход был оптимизирован для использования деградированных FFPE РНК от образцов архивирован до 35 лет и обеспечивает высокую воспроизводимость данных NGS.
Introduction
интерферирующим удивительно хорошо сохраняются в формалин Исправлена парафин врезанных (FFPE) образцов1,2,3. Предыдущая работа продемонстрировала, что выражение этих коротких регулирования-кодирования одного мель молекул РНК может быть успешно оцениваются с помощью всего РНК из образцов FFPE и предоставить соответствующий ген выражение данных по сравнению с оригинальной свежие ткани4,5,6,,78. По сравнению с большого размера messenger РНК, которые показали критически пострадать от FFPE обработки тканей (формальдегид, тепла, сушки и т.д.), эндогенных полиадениновый и возраст образцов, небольшой размер интерферирующим (~ 18 – 24 нуклеотидов) появляется, чтобы сделать их устойчивыми к деградации и устойчивыми для длительного хранения, также продемонстрировал через Мирна выражение исследований, которые превосходят высок объём мРНК исследования в архивных образцов9. Мирна выражение исследования с использованием архивных клинических образцов, которые выполнялись главным образом в небольших анализов, показал что сингл или мультиплексированных количественные анализы ПЦР, различные виды технологии microarray дна и совсем недавно NGS можно использоваться для оценки выражение сохранились интерферирующим после оптимизации этих анализов10,11,12,,1314.
Учитывая, что регуляции экспрессии Мирна был связан с разработкой целого ряда злокачественных опухолей человека и что потенциально существует огромное количество клинически аннотированной архивных образцов, очевидно, что эти малые РНК молекулы представляют собой перспективный источник потенциального рака Биомаркеры15,16,17,18. Использование технологий выражение гена высокой пропускной способности, таких как NGS имеет преимущество обеспечения глобальной оценки всех Мирна стенограмм, по сравнению с целевые технологии, такие как ПЦР или microarrays19. По этой причине оптимизированная, доступным и легко применимым протокол кДНК библиотеки подготовке малых РНК от старых архивных образцов для NGS был оптимизирован для включения крупных ретроспективных исследований20.
Ранее мы создали одновременно протокол извлечения РНК/ДНК для отдельных восстановления ДНК и РНК из старых архивных образцов, которые мы нашли, чтобы превзойти современные коммерческие наборы21. Используя этот протокол извлечения для получения всего РНК из FFPE тканей в Архив для длительного периода времени, мы оптимизировали подготовку кДНК библиотек для NGS адаптивной, сохранились в клинических образцах до 35 лет. Кроме того в недавно опубликованном исследовании, где мы подготовили кДНК библиотек от клинически секретной протоковой карциномы в situ (DCIS) образцов, мы определили дифференциально выраженной адаптивной, которые были подтверждены количественного PCR, который указал что конкретные Мирна выражения изменения могут быть обнаруживаемыми в DCIS поражения от пациентов, которые развитие рака молочной железы по сравнению с DCIS поражения от пациентов, которые не развиваться рак молочной железы.
Учитывая стоимость коммерческих комплекты для подготовки малых РНК кДНК библиотек, потенциал для их прекращения, а также использование защищенных авторским правом/патент реагентов, которые не могут быть оптимизированы мы решили адаптировать ранее опубликованные на базе лаборатории и бесплатный комплект 3′ перепутываются cDNA библиотека подготовки протокола для NGS малых РНК, архивируются в FFPE образцах, позволяя одновременный анализ 18 образцов22. Этот протокол обеспечивает идеальное и надежные пошаговую процедуру с визуальной и технической оценки контрольно-пропускные пункты, имеющие важное значение для адаптации к FFPE РНК образцов, и имеет большой потенциал для применения к другим источникам нарушенной или трудно чтобы использовать материал РНК. Оригинального протокола применимость была улучшена, заменив радиоактивно помечены размер маркеров флуоресцентные (например, SYBR золото) обнаружить РНК размер маркеров во время отбора перевязаны библиотек на больших полиакриламидных гелей. Этот оптимизированный протокол основывается на перевязку 3′ перепутываются адаптеры для 18 отдельных образцов FFPE РНК, которые затем объединить вместе, чтобы пройти 5′ адаптер перевязки, реверс транскрипции и экспериментальный анализ ПЦР для специально амплификация cDNA окончательный Библиотека до крупномасштабных амплификации PCR, очистки и NGS на секвенсор высокой пропускной способности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Высокую воспроизводимость и надежные cDNA библиотека подготовки протокола для NGS малых РНК, архивируются в FFPE РНК образцы представлены в этот протокол, который является изменение и оптимизированные версии процедуры, описанной Хафнер и др. 22
Все этапы это?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Томас Tuschl, заведующий лабораторией молекулярной биологии РНК, а также членов его лаборатории для их поддержки и обмена технология, разработанная в его лаборатории и обеспечение доступа к RNAworld трубопроводу. Мы также благодарим д-р Маркус Hafner его протокол обмена и предоставления подробных описаний на всех биохимических и ферментативные шаги, используемые в его первоначальной процедуры.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
- Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure–DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
- Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
- Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
- Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
- Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
- Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
- Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
- Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
- Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
- Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
- Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
- Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
- Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
- Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
- Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
- Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
- Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
- Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
- Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
- Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
- Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).
