Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver
Summary
Formalin-fast paraffin-indlejrede enheder udgør en værdifuld kilde til molekylære markører af sygdomme hos mennesker. Her præsenterer vi en laboratorium-baseret cDNA bibliotek forberedelse protokol, oprindeligt designet med frisk frosset RNA, og optimeret til analyse af arkiverede MicroRNA fra væv gemt op til 35 år.
Abstract
– Arkiveret, klinisk klassificeret formalin-fast kan paraffin-embedded (FFPE) væv give nukleinsyrer til retrospektiv molekylære studier af udviklingen af kræft. Ved hjælp af non-invasive eller præmaligne læsioner fra patienter, der senere udvikler invasiv sygdom, kan gen expression analyser hjælpe med at identificere tidlige molekylære ændringer, der prædisponerer til kræftrisiko. Det har været godt beskrevet, at nukleinsyrer inddrives fra FFPE væv har undergået alvorlige fysiske skader og kemiske ændringer, hvilket vanskeliggør deres analyse og generelt kræver tilpasset assays. MicroRNA (miRNAs), men som repræsenterer en lille klasse af RNA molekyler spanning kun op til ~ 18 – 24 nukleotider, har vist sig at modstå langtidsopbevaring og med held har analyseret i FFPE prøver. Her præsenterer vi en 3′ barcoded supplerende DNA (cDNA) bibliotek forberedelse protokollen specielt optimeret til analyse af små RNA’er udvundet af arkiverede væv, der var for nylig vist sig for at være robust og stærkt reproducerbare når ved hjælp af arkiveret kliniske prøver opbevares i op til 35 år. Dette bibliotek forberedelse er godt tilpasset til de multiplex analyse af kompromitteret/nedbrudt materiale hvor RNA prøver (op til 18) er forbundet med individuelle 3′ barcoded adaptere og derefter samles sammen for efterfølgende enzymatiske og biokemiske præparater forudgående analyse. Alle purifications udføres af polyacrylamid gelelektroforese (side), som tillader størrelse-specifikke valg og enrichments af barcoded små RNA arter. Denne cDNA bibliotek forberedelse er veltilpasset til minut RNA indgange, som en pilot Polymerasekædereaktionen (PCR) giver mulighed for bestemmelse af en specifik forstærkning cyklus til at producere optimale mængder af materiale til næste generation sequencing (NGS). Denne metode var optimeret til anvendelse af forringede FFPE RNA fra prøver arkiveret i op til 35 år og giver meget reproducerbare NGS data.
Introduction
miRNAs er bemærkelsesværdigt godt bevaret i formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) enheder1,2,3. Tidligere arbejde har vist, at udtryk for disse korte regulerende ikke-kodende enkelt strandede RNA molekyler med succes kan evalueres ved hjælp af total RNA fra FFPE prøver og give relevante genekspression data i forhold til den oprindelige friske væv4,5,6,7,8. Sammenlignet med store messenger RNA’er, som har vist sig at være alvorligt påvirket af FFPE væv forarbejdning (formaldehyd, varme, udtørring, etc.), endogene RNases og alder af prøverne, den lille størrelse af miRNAs (~ 18 – 24 nukleotider) ser ud til at gøre dem resistente over for nedbrydning og robust til langtidsopbevaring, også demonstreret gennem miRNA udtryk undersøgelser, der udkonkurrerer høj overførselshastighed mRNA undersøgelser i arkiverede prøver9. miRNA udtryk undersøgelser ved hjælp af arkiverede kliniske prøver, der er for det meste udført i små analyser, har påvist, at single eller multipleksede kvantitativ PCR assays, forskellige typer af microarray teknologi, og senest NGS kan bruges til at vurdere udtryk for konserverede miRNAs efter optimering af disse assays10,11,12,13,14.
Eftersom dysregulering af miRNA udtryk har været forbundet med udviklingen af en række menneskelige maligniteter og at der er potentielt et enormt udbud af klinisk kommenteret arkiverede eksemplarer, har det vist sig at disse små RNA molekyler udgør en lovende kilde til potentiel kræft biomarkører15,16,17,18. Brug af en høj overførselshastighed gen expression teknologi såsom NGS har fordelen at give en global evaluering af alle miRNA udskrifter i forhold til målrettede teknologier såsom PCR og/eller microarrays19. Derfor var en optimeret, overkommelig og let anvendelig protokol til cDNA bibliotek tilberedning af små RNA’er fra ældre arkiverede prøver til NGS optimeret for at aktivere store retrospektive undersøgelser20.
Vi har tidligere etableret en samtidige RNA/DNA udvinding protokol for særskilt genvinding af RNA og DNA fra ældre arkiverede prøver, som vi fandt for at excellere moderne kommercielle kits21. Bruger denne udvinding protokol, for at opnå total RNA fra FFPE væv arkiveret i længere periode af gange, optimeret vi fremstilling af cDNA-biblioteker til NGS af miRNAs bevaret i klinisk prøvemateriale til op til 35 år. Desuden, i en nyligt offentliggjort undersøgelse hvor vi forberedt cDNA-biblioteker fra klinisk klassificerede duktalt karcinom i situ (DCIS) enheder, vi identificeret varierende udtrykt miRNAs, som blev godkendt af kvantitativ PCR, som er angivet at specifikke miRNA udtryk ændringer må kunne påvises i DCIS-læsioner fra patienter, der udvikler brystkræft sammenlignet med DCIS-læsioner fra patienter, der ikke udvikler brystkræft.
I betragtning af omkostningerne ved kommercielle kits til tilberedning af små RNA cDNA biblioteker, potentialet for deres seponering, samt anvendelse af copyright/patent-beskyttet reagenser, der ikke kan optimeres, besluttede vi at tilpasse en tidligere offentliggjort laboratorium-baseret og kit-fri 3′ barcoded cDNA bibliotek forberedelse protokol for NGS af små RNA’er arkiveret i FFPE prøver, tillader simultan analyse af 18 prøver22. Denne protokol indeholder en ideel og robust trinvis procedure med visuel og teknisk evaluering kontrolposter, som var afgørende for tilpasning til FFPE RNA prøver, og har et stort potentiale for anvendelse til andre kilder af kompromitteret eller vanskeligt at bruge RNA materiale. Den originale protokol anvendelighed blev forbedret ved at erstatte radioaktivt mærket størrelse markører med fluorescerende (fxSYBR guld) påviselige RNA størrelse markører, der anvendes under udvælgelsen af sammenskrevne biblioteker på store polyacrylamidgeler. Denne optimerede protokol bygger på ligatur af 3′ barcoded adaptere til 18 enkelte FFPE RNA prøver, som er så samles sammen for at gennemgå 5′ adapter ligatur, reverse-transskription og en pilot PCR-analyse for skræddersyet forstærkning af den endelige cDNA biblioteket før storstilet PCR-amplifikation, rensning og NGS på en høj overførselshastighed sequencer.
Protocol
Representative Results
Discussion
En meget reproducerbare og robust cDNA bibliotek forberedelse protokol til NGS af små RNA’er arkiveret i FFPE RNA prøver er præsenteret i denne protokol, som er en modificeret og optimeret version af proceduren beskrevet af Hafner et al. 22
Alle trin i denne protokol er blevet optimeret til brug med ældre arkiverede og kompromitteret total RNA inddrives fra FFPE prøver. Det vigtigste skridt i denne protokol, for behandling af små mængder af FFPE RNA, er …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Thomas Tuschl, leder af laboratoriet for RNA molekylær biologi, samt medlemmer af hans laboratorium for deres støtte og for at dele teknologi udviklet i hans laboratorium og giver adgang til RNAworld-rørledningen. Vi takker også Dr. Markus Hafner til at dele hans protokol og giver detaljerede beskrivelser på alle biokemiske og enzymatiske trin bruges i hans indledende procedure.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
- Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure–DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
- Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
- Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
- Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
- Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
- Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
- Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
- Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
- Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
- Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
- Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
- Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
- Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
- Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
- Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
- Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
- Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
- Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
- Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
- Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
- Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).
