רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות
Summary
פורמלין-קבוע דגימות פרפין-מוטבע מהווים מקור חשוב של סמנים מולקולריים של מחלות אנושיות. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכנה ספריית cDNA מבוסס המעבדה, בתחילה עוצב עם RNA טריים קפואים, באופן מיטבי עבור הניתוח של מיקרו Rna בארכיון של רקמות מאוחסן עד 35 שנים.
Abstract
– בארכיון, קלינית מסווגים פורמלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות (FFPE) יכול לספק חומצות גרעין ללימודי מולקולרית רטרוספקטיבה של התפתחות סרטן. באמצעות נגעים לא פולשנית או טרום ממאיר של חולים אשר מאוחר יותר לפתח מחלה פולשנית, ניתוחים ביטוי גנטי עשוי לעזור לזהות שינויים מולקולריים מוקדם שגורמים את הסיכון לסרטן. זה טוב תואר חומצות גרעין התאוששה FFPE רקמות עברו נזק פיזי חמור, שינויים כימיים, אשר תעשה שלהם ניתוח קשה ודורש בדרך כלל מבחני מותאם. מיקרו Rna (miRNAs), עם זאת, אשר מייצגים את שיעור קטן של מולקולות RNA פורש רק עד ~ 18 – 24 נוקלאוטידים, הוכחו לעמוד לאחסון לטווח ארוך, יש נותחו בהצלחה בדגימות FFPE. כאן אנו מציגים 3′ לבר-קוד משלים דנ א (cDNA) ספריית הכנה פרוטוקול במיוחד ממוטבים לניתוח של RNAs קטן שחולצו מן הרקמות שאוחסנו בארכיון, אשר הודגם לאחרונה להיות חזקים מאוד לשחזור בעת שימוש בארכיון דגימות קליניות מאוחסן עד 35 שנים. הכנת ספריה הוא מותאם לניתוח מולטיפלקס של החומר נחשף/השפיל בהם דוגמאות RNA (עד 18) מאתרים עם מתאמי לבר-קוד בודדות 3′, ואז איחדו יחד על ההכנות אנזימטי וביוכימי עוקבות לפני ניתוח. כל purifications מתבצעים על ידי לזיהוי בג’ל (עמוד), אשר מאפשר הבחירות הספציפיות גודל ו enrichments מינים RNA קטנים לבר-קוד. הכנת ספריית cDNA הוא מותאם תשומות RNA דקה, כמו טייס תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) מאפשרת קביעה של מעגל הגברה מסוימת לייצר סכומי מיטביים של חומר עבור הדור הבא רצפי (הגדרות). גישה זו היה מותאם לשימוש של RNA מפורק FFPE של דגימות בארכיון עד 35 שנים ומספק ביותר לשחזור נתונים המיתרים.
Introduction
miRNAs ההכפלה שמורים להפליא היטב פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) דגימות1,2,3. העבודות הקודמות הוכיחה כי הביטוי של אלה קצרה תקינה ללא קידוד יחיד נטושים מולקולות RNA יכול בהצלחה להעריך באמצעות RNA הכולל מדגימות FFPE, לספק נתונים ביטוי גנים הרלוונטיים בהשוואה הטרייה המקורי רקמות4,5,6,7,8. בהשוואה RNAs שליח גדול, אשר הוכחו להיות מושפעת באופן ביקורתי עיבוד רקמות (פורמלדהיד, חום, לייבוש, וכו ‘) FFPE, RNases אנדוגני, הגיל של דגימות, גודל קטן של miRNAs (~ 18 – 24 נוקלאוטידים) מופיעה כדי שיהיו עמידים בפני השפלה וגמיש לאחסון לטווח ארוך, גם הדגימו באמצעות מחקרים ביטוי miRNA לפעול טוב יותר תפוקה גבוהה לימודי ה-mRNA דגימות בארכיון9. miRNA ביטוי מחקרים באמצעות דגימות קליניות בארכיון, אשר רובם בוצעו בניתוח בקנה מידה קטן, הפגינו הסינגל או מרובב מבחני ה-PCR כמותי, סוגים שונים של טכנולוגיות microarray, ולאחרונה המיתרים יכול ניתן להשתמש כדי להעריך את הביטוי של miRNAs נשמר לאחר אופטימיזציה של אלה מבחני10,11,12,13,14.
בהתחשב בכך dysregulation של הביטוי miRNA היה קשור עם פיתוח מגוון רחב של גידולים ממאירים האנושית, שיש כאן פוטנציאל אטומטי העצום של קלינית מבואר דגימות בארכיון, זה הפך להיות לכאורה כי אלה RNA קטנים מולקולות מייצגים מבטיח מקור פוטנציאלי סרטן סמנים ביולוגיים15,16,17,18. השימוש בטכנולוגיה ביטוי גנים תפוקה גבוהה כגון הגדרות יש את היתרון של מתן הערכה גלובלית של כל הפרוטוקולים miRNA בהשוואה לטכנולוגיות יישוב כגון PCR ו/או מיקרו-מערכים19. מסיבה זו, פרוטוקול ממוטבת, ובמחיר בקלות החלים על הכנה ספריית cDNA של RNAs קטנים של מבוגר דגימות בארכיון עבור הגדרות אופטימלי כדי לאפשר מחקרים רטרוספקטיבית רחבת היקף20.
הקמנו בעבר פרוטוקול מיצוי RNA/DNA סימולטני להתאוששות נפרדים של RNA ו- DNA דגימות בארכיון בוגרים, אשר מצאנו כדי לפעול טוב יותר עכשווי קיטים מסחריים21. באמצעות פרוטוקול זה החילוץ, כדי להשיג RNA הכולל רקמות FFPE בארכיון לתקופה ממושכת של פעמים, אנו אופטימיזציה ההכנה של ספריות cDNA המיתרים של miRNAs המשומרים דגימות קליניות עד 35 שנים. יתרה מכך, במחקר שפורסם לאחרונה שבו הכנו cDNA ספריות קרצינומה ductal קלינית מסווג , באתרו (DCIS) דגימות, זיהינו באופן שונה ביטוי miRNAs היו לאימות על ידי PCR כמותי, אשר הצביע כי שינויים בביטוי miRNA מסוימים עשויים להיות לזיהוי בנגעים DCIS מחולים מי לפתח סרטן השד בהשוואה ל- DCIS נגעים של חולים אשר אינם מפתחים סרטן השד.
בהתחשב העלות של ערכות מסחריות להכנה של ספריות cDNA RNA קטנים, את הפוטנציאל שלהם הפסקה, כמו גם את השימוש ריאגנטים המוגנים בזכויות יוצרים/פטנט שלא יכול להיות מוטב, החלטנו להתאים שפורסמו בעבר מבוסס המעבדה ונטולת ערכת 3′ לבר-קוד cDNA ספריית הכנת פרוטוקול עבור הגדרות של RNAs קטן בארכיון ב FFPE דגימות, המאפשר ניתוח בו זמנית של 18 דוגם22. פרוטוקול זה מספק הליך שלב אחר שלב אידיאלי וחזק עם הערכה הטכניים מחסומים, שהיו קריטי עבור ההסתגלות דגימות FFPE RNA, ויש לו פוטנציאל חזק עבור יישום למקורות אחרים של פרוץ או קשה כדי להשתמש בחומר RNA. הישימות של הפרוטוקול המקורי היה משופר על ידי החלפת סמני גודל radioactively שכותרתו עם פלורסנט (למשל, זהב SYBR) לזיהוי סמני גודל של RNA, בשימוש במהלך הבחירה של ספריות מחוברים על גדול לזיהוי ג’לים. פרוטוקול ממוטבת זה מסתמך על מצדו של 3′ מתאמי לבר-קוד כדי 18 דגימות FFPE RNA בודדים, אשר ואז איחדו יחד לעבור 5′ מתאם מצדו, הפוכה-תמלול ולאחר ניתוח PCR פיילוט עבור המותאמים הגברה של cDNA סופית ספריית לפני בקנה מידה גדול PCR הגברה טיהור, המיתרים על ברצף תפוקה גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול הכנה ספריית cDNA חזקים הדירים מאוד עבור הגדרות של RNAs קטן בארכיון ב- FFPE RNA דגימות מוצג פרוטוקול זה, אשר היא גרסה שהשתנתה וממוטב של ההליך המתואר על ידי Hafner. et al. 22
כל השלבים של פרוטוקול זה מוטבו לשימוש עם בוגרים RNA הכולל, בארכיון, פרוץ התאוששה FFPE דגימות. הש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ד ר תומאס Tuschl, ראש המעבדה לביולוגיה מולקולרית RNA, כמו גם חברי המעבדה שלו על תמיכתם ועל שיתוף הטכנולוגיה שפותחה מעבדה ועל מתן גישה הצינור RNAworld. אנו מודים גם ד ר מרקוס Hafner שיתוף הפרוטוקול, לספק תיאורים מפורטים על כל השלבים הביוכימי, אנזימטי היה בהליך הראשוני שלו.
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
- Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
- Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure–DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
- Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338 (2015).
- Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
- Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
- Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
- Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
- Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393 (2013).
- Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
- Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
- Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
- Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
- Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
- Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
- Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
- Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
- Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
- Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
- Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
- Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
- Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683 (2012).
- Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
- Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).
