पूर्वव्यापी MicroRNA अनुक्रमण: पूरक डीएनए लाइब्रेरी तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग Formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड आरएनए नमूनों
Summary
Formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड नमूनों मानव रोगों के आणविक के एक महत्वपूर्ण स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । यहाँ हम एक प्रयोगशाला आधारित सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल, शुरू में ताजा जमे हुए आरएनए के साथ बनाया गया है, और ३५ साल तक संग्रहीत ऊतकों से संग्रहीत microRNAs के विश्लेषण के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
-संग्रहीत, चिकित्सकीय वर्गीकृत formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतकों को कैंसर के विकास के पूर्वव्यापी आण्विक अध्ययन के लिए न्यूक्लिक एसिड प्रदान कर सकते हैं । रोगियों को जो बाद में इनवेसिव रोग का विकास से गैर इनवेसिव या पूर्व घातक घावों का उपयोग करके, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण मदद जल्दी आणविक परिवर्तन है कि कैंसर के जोखिम को कम करने की पहचान कर सकते हैं । यह अच्छी तरह से वर्णित किया गया है कि न्यूक्लिक FFPE ऊतकों से बरामद एसिड गंभीर शारीरिक क्षति और रासायनिक संशोधनों, जो उनके विश्लेषण करना मुश्किल है और आम तौर पर परख अनुकूलित की आवश्यकता है आया है । MicroRNAs (miRNAs), तथापि, जो आरएनए केवल अप करने के लिए फैले अणुओं के एक छोटे से वर्ग का प्रतिनिधित्व करने के लिए ~ 18 – 24 न्यूक्लियोटाइड, लंबी अवधि के भंडारण का सामना करने के लिए दिखाया गया है और सफलतापूर्वक FFPE नमूनों में विश्लेषण किया गया है. यहाँ हम एक 3 बारकोड पूरक डीएनए (सीडीएनए) पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल विशेष रूप से संग्रहीत ऊतकों से निकाले गए छोटे RNAs के विश्लेषण के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करते हैं, जो हाल ही में मजबूत और अत्यधिक reproducible जब संग्रहीत का उपयोग कर प्रदर्शित किया गया था नैदानिक नमूनों के लिए ३५ साल के लिए संग्रहीत । इस पुस्तकालय की तैयारी अच्छी तरह से समझौता/नीचा सामग्री के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, जहां आरएनए नमूने (18 तक) व्यक्तिगत 3 ‘ बारकोड एडाप्टर के साथ ligated रहे हैं और फिर बाद में एंजाइमी और जैव रासायनिक तैयारी के लिए एक साथ परित विश्लेषण करने से पहले । सभी शुद्धि polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) है, जो आकार विशिष्ट चयन और बारकोड छोटे आरएनए प्रजातियों के संवर्धन की अनुमति देता द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं । इस सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी अच्छी तरह से मिनट आरएनए आदानों के लिए अनुकूलित है, एक पायलट पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के रूप में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) के लिए सामग्री की इष्टतम मात्रा का उत्पादन करने के लिए एक विशिष्ट प्रवर्धन चक्र का निर्धारण की अनुमति देता है. यह दृष्टिकोण ३५ साल तक के लिए संग्रहीत नमूनों से नीचा FFPE आरएनए के उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था और अत्यधिक reproducible NGS डेटा प्रदान करता है.
Introduction
miRNAs उल्लेखनीय अच्छी तरह से formalin में संरक्षित कर रहे है-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) नमूनों1,2,3। पिछले काम का प्रदर्शन किया है कि इन लघु विनियामक गैर कोडिंग एकल असहाय आरएनए अणुओं की अभिव्यक्ति सफलतापूर्वक FFPE नमूनों से कुल आरएनए का उपयोग कर मूल्यांकन कर सकते है और प्रासंगिक जीन अभिव्यक्ति डेटा प्रदान जब मूल की तुलना में ताजा ऊतकों4,5,6,7,8। जब बड़े आकार के दूत RNAs, जो गंभीर रूप से FFPE ऊतक प्रसंस्करण (formaldehyde, गर्मी, सुखाना, आदि), अंतर्जात RNases, और नमूनों की उंर से प्रभावित होना दिखाया गया है की तुलना में, miRNAs के छोटे आकार (~ 18 – 24 न्यूक्लियोटाइड) के लिए उंहें क्षरण और लंबी अवधि के भंडारण के लिए लचीला करने के लिए प्रतिरोधी प्रतीत होता है, यह भी miRNA अभिव्यक्ति अध्ययन के माध्यम से प्रदर्शन किया है कि मात उच्च प्रवाह में mRNA अध्ययन के नमूने9। miRNA अभिव्यक्ति संग्रहीत नैदानिक नमूनों, जो ज्यादातर छोटे पैमाने पर विश्लेषण में प्रदर्शन किया गया है का उपयोग कर अध्ययन, प्रदर्शन किया है कि एकल या मल्टीप्लेक्स मात्रात्मक पीसीआर परख, microarray प्रौद्योगिकियों के विभिंन प्रकार, और सबसे हाल ही में NGS कर सकते है इन परख के अनुकूलन के बाद संरक्षित miRNAs की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए किया जा10,11,12,13,14।
यह देखते हुए कि miRNA अभिव्यक्ति की dysregulation मानव द्रोह की एक किस्म के विकास के साथ जुड़ा हुआ है और वहां संभवतः नैदानिक व्याख्या संग्रहीत नमूनों की एक विशाल आपूर्ति है, यह स्पष्ट हो गया है कि इन छोटे आरएनए अणु संभावित कैंसर के एक होनहार स्रोत15,16,17,18का प्रतिनिधित्व करते हैं । ऐसे NGS के रूप में एक उच्च प्रवाह जीन अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी के उपयोग के सभी miRNA टेप के एक वैश्विक मूल्यांकन प्रदान करने का लाभ है जब ऐसी पीसीआर और/या microarrays19के रूप में लक्षित प्रौद्योगिकियों की तुलना में/ इस कारण से, एक अनुकूलित, सस्ती, और NGS के लिए पुराने संग्रहीत नमूनों से छोटे RNAs के सीडीएनए पुस्तकालय की तैयारी के लिए आसानी से लागू प्रोटोकॉल के लिए बड़े पैमाने पर पूर्वव्यापी अध्ययन20सक्षम अनुकूलित किया गया था ।
हम पहले से आरएनए और डीएनए की अलग वसूली के लिए एक एक साथ आरएनए/डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल की स्थापना की है जो हम समकालीन वाणिज्यिक किट21मात करने के लिए पाया पुराने संग्रहीत नमूनों, से । इस निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करना, FFPE ऊतकों से कुल आरएनए प्राप्त करने के लिए समय की विस्तारित अवधि के लिए संग्रहीत, हम ३५ वर्ष तक के लिए नैदानिक नमूनों में संरक्षित miRNAs के NGS के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी अनुकूलित. इसके अलावा, एक हाल ही में प्रकाशित अध्ययन में जहां हम सीटू (DCIS) नमूनों में नैदानिक वर्गीकृत डक्टर कार्सिनोमा से सीडीएनए पुस्तकालयों तैयार, हम अंतर व्यक्त की पहचान की है कि मात्रात्मक पीसीआर, जो संकेत दिया द्वारा मान्य किया गया miRNAs कि विशिष्ट miRNA अभिव्यक्ति परिवर्तन रोगियों को जो स्तन कैंसर का विकास नहीं है, जो रोगियों से DCIS घावों की तुलना में DCIS घावों में पहचाने जा सकता है ।
छोटे आरएनए सीडीएनए पुस्तकालयों की तैयारी के लिए वाणिज्यिक किट की लागत को ध्यान में रखते हुए, उनके विच्छेदन के लिए संभावित, साथ ही कॉपीराइट का उपयोग/पेटेंट-संरक्षित एजेंट है कि अनुकूलित नहीं किया जा सकता है, हम एक पहले से प्रकाशित अनुकूलन का फैसला किया प्रयोगशाला आधारित और किट-नि: शुल्क 3 बारकोड FFPE नमूनों में संग्रहीत छोटे RNAs के NGS के लिए सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल, 18 नमूनों की एक साथ विश्लेषण की अनुमति22. इस प्रोटोकॉल दृश्य और तकनीकी मूल्यांकन चौकियों, जो FFPE आरएनए नमूनों के लिए अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण थे के साथ एक आदर्श और मजबूत कदम दर कदम प्रक्रिया प्रदान करता है, और समझौता या मुश्किल के अन्य स्रोतों के लिए आवेदन के लिए एक मजबूत क्षमता है आरएनए सामग्री का उपयोग करने के लिए. मूल प्रोटोकॉल प्रयोज्य फ्लोरोसेंट के साथ रेडियोधर्मी लेबल आकार मार्करों की जगह द्वारा सुधार किया गया था (उदा., SYBR गोल्ड) detectable आरएनए आकार मार्करों बड़े polyacrylamide जैल पर ligated पुस्तकालयों के चयन के दौरान इस्तेमाल किया । यह अनुकूलित प्रोटोकॉल तो 5 ‘ अनुकूलक बंधाव, रिवर्स-प्रतिलेखन, और अंतिम सीडीएनए के अनुरूप प्रवर्धन के लिए एक पायलट पीसीआर विश्लेषण से गुजरना के लिए एक साथ परित हैं, जो 18 व्यक्तिगत FFPE आरएनए नमूनों के लिए 3 ‘ बारकोड एडाप्टर के बंधाव पर निर्भर करता है पुस्तकालय बड़े पैमाने पर पीसीआर प्रवर्धन, शुद्धि, और एक उच्च प्रवाह sequencer पर NGS करने से पहले ।
Protocol
Representative Results
Discussion
FFPE आरएनए नमूनों में संग्रहीत छोटे RNAs के NGS के लिए एक अत्यंत reproducible और मजबूत सीडीएनए पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया गया है, जो हैफनर एट अल द्वारा वर्णित प्रक्रिया का एक संशोधि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ थॉमस Tuschl, आरएनए आणविक जीवविज्ञान के लिए प्रयोगशाला के प्रमुख, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनके समर्थन के लिए और अपनी प्रयोगशाला में विकसित प्रौद्योगिकी साझा करने और RNAworld पाइप लाइन के लिए उपयोग प्रदान करने के लिए अपनी प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए धन्यवाद. हम भी अपने प्रोटोकॉल साझा करने और सभी जैव रासायनिक और एंजाइमी अपने प्रारंभिक प्रक्रिया में इस्तेमाल किया कदम पर विस्तृत विवरण प्रदान करने के लिए Dr. Markus हैफनर धंयवाद ।
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
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