ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル
Summary
ホルマリン固定パラフィン包埋標本を表す人間の病気の分子バイオ マーカーの貴重な情報源。実験に基づく cDNA ライブラリの準備プロトコル、最初に新鮮な冷凍 RNA をデザインおよび最適化組織からアーカイブされたマイクロ Rna の解析に格納された 35 歳までをご紹介します。
Abstract
-アーカイブ、ホルマリン固定を臨床的に分類 (FFPE) 組織のパラフィン包埋は癌の開発の回顧的な分子研究の核酸を提供できます。後で侵襲性疾患を発症した患者から非侵襲や前癌性病変を使用して、遺伝子発現解析は、癌リスクにし向ける初期の分子変化を識別を助けるかもしれない。FFPE 組織から回復した核酸が深刻な物理的な損傷及びその分析が難しく、一般的に適応アッセイ化学修正を受けているも記載されています。マイクロ Rna (Mirna) ただし、少人数のクラスを表す長期保存に耐えるし、FFPE サンプルの解析に成功するまでのみ 〜 18-24 をまたがる RNA 分子のヌクレオチドが示されています。ここで提案する、3′ バーコード相補的 DNA (cDNA) ライブラリの準備のプロトコル堅牢かつ再現性の高いアーカイブを使用する場合に示された最近アーカイブされた組織から抽出した低分子 Rna の解析用に最適化されました。35 年間の臨床標本。このライブラリの準備 (18) までの RNA のサンプルを個別 3′ バーコード アダプターで結紮、後続の生化学的酵素の準備のため一緒にプールし、侵害された劣化材料の多重解析に適しています分析する前に。すべての浄化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) サイズ固有選択とバーコード小さな RNA 種の濃縮が可能で行われます。この cDNA ライブラリの準備は、次世代シーケンサー (NGS) のための材料の最適な量を生成する特定の増幅サイクルの決定により、パイロットのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 分の RNA 入力によく合わせられる。このアプローチは、最大 35 年間のアーカイブの標本から劣化した FFPE RNA の使用のために最適化された、NGS の再現性の高いデータを提供します。
Introduction
Mirna がホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 標本1,2,3非常によく保存されています。前作はこれら短い規制非コード鎖 RNA 分子の式 FFPE サンプルからの総 RNA を使用して正常に評価することができ、元の新鮮なと比較した場合の関連する遺伝子発現データを示しています。組織4,5,6,7,8。大型メッセンジャー RNAs は、批判的に FFPE ティッシュの処理 (ホルムアルデヒド、熱、乾燥、等)、内因性 RNases、miRNAs (~ 18-24 の小型試験片の年齢によって影響を受けることが示されていると比較した場合ヌクレオチド) の低下に耐性とアーカイブされた標本9の高スループット mRNA 研究をアウトパ フォームする miRNA 発現研究により実証するも、長期的なストレージに弾力性のあるようにするが表示されます。各種マイクロ アレイ技術と最も最近 NGS、大抵小規模解析で行われている、アーカイブの臨床検体を用いた miRNA 発現研究がその 1 つを示したまたは定量的 PCR の試金を多重化これらの試金の10、11,12,13,14の最適化後保存 Mirna の発現を評価するために使用します。
MiRNA 発現の調節不全は、さまざまなひと悪性腫瘍の開発に関連付けられている、アーカイブされた標本に注釈を付けることがある潜在的の巨大な供給臨床的に、明らかになるが、これらの小さな RNA分子は、潜在的な癌バイオ マーカー15,16,17,18の有望なソースを表します。NGS などの高速遺伝子発現技術の使用すべての miRNA 議事 PCR および/またはマイクロ アレイ19など対象のテクノロジと比較したときのグローバルな評価を提供することの利点があります。このため、NGS の古いアーカイブされた標本からの Rna の cDNA ライブラリの準備のために最適化された、手頃な価格で、簡単に該当するプロトコル20大規模な回顧的な研究を可能にする最適化を行った。
以前、現代的な商業キット21をアウトパ フォームすることがわかった古いのアーカイブされた標本からの RNA と DNA の別個の回復の同時 RNA/DNA の抽出のプロトコルを設立しました。この抽出のプロトコルを使用すると、時間の延長期間にアーカイブ FFPE 組織からの総 RNA を取得、miRNAs の 35 年間の臨床検体の保存の NGS の cDNA ライブラリの準備を最適化されています。さらに、最近発行された研究はどこ我々 は cDNA ライブラリからその場で臨床的に分類された乳管癌 (DCIS) 標本を作製、示される定量的 PCR によって検証された発現の Mirna がわかりました特定のマイクロ Rna 発現が変化することは、DCIS 乳癌乳癌を発症しない患者から浸潤病変と比較して発症した患者から病変の検出可能性があります。
最適化できない特許/著作権保護されている試薬の使用と同様、商業キット小さな RNA の cDNA ライブラリの準備のため、その中止の可能性のコストを考慮して以前に発行された適応することにしました実験室ベースし、キット無料 3′ バーコード cDNA ライブラリ FFPE 標本でアーカイブされる低分子 Rna の NGS のプロトコル準備、22のサンプル 18 の同時解析を許可します。このプロトコルは FFPE RNA 試料への適応のために重大だった、外観および技術的な評価のチェックポイントと理想的なステップバイ ステップの手順を提供し、妥協の困難な他の情報源への適用の強い可能性があります。RNA の材料を使用します。元の議定書の適用性 (例えばSYBR 金) 蛍光放射能標識サイズ マーカーを置き換えることによって改善された大きいポリアクリルアミドゲルに結紮図書館の選択時に使用される RNA サイズ マーカーを検出します。最適化されたプロトコルはこの 3′ が 18 個々 FFPE RNA 標本にバーコードのアダプターの ligation 依存し、5′ アダプター結紮術を受けることに一緒にプール、逆転写とパイロットの PCR 解析合わせた最終的な cDNA の拡大高速シーケンサーの大規模な PCR 増幅、浄化、NGS の前にライブラリ。
Protocol
Representative Results
Discussion
・ ハフナーらによって記述されたプロシージャの変更および最適化されたバージョンは、このプロトコルの FFPE RNA 標本でアーカイブされる低分子 Rna の NGS の高再現性と堅牢な cDNA ライブラリの準備のプロトコルを表示します。22
このプロトコルのすべてのステップは、古いアーカイブと侵害された総 RNA FFPE の標本から回復を使用するため最適?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
博士トーマスされた、RNA の分子生物学の実験室の頭部だけでなく、彼らのサポートのため、彼の実験室および RNAworld パイプラインにアクセスを提供する技術を共有するため彼の研究室のメンバーに感謝いたします。我々 はまた、彼のプロトコルを共有し、彼の最初の手順で使用されているすべての生化学的および酵素の手順に関する詳細な説明を提供するため博士マーカス ・ ハフナーを感謝します。
Materials
| 1% Triton x-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| 10mM ATP | Ambion | AM8110G | |
| 10X dNTPs | Ambion | AM8110G | |
| 10x TBE | Thermofisher Scientific | 15581044 | |
| 14M Mercaptoethanol | Sigma | O3445I-100 | |
| 20 nt ladder | Jena Bioscience | M-232S | |
| 20mg/ml Bovine Serum Albumine | Sigma | B8894-5ML | |
| 50X Titanium Taq | Clontech Laboratories | 639208 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | 7727-54-0 | |
| BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs | GIBCO | V16 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D9170-5VL | |
| Eppendorf microcentrifuge 5424R | USA scientific | 4054-4537Q | |
| Eppndorf Thermomixer | USA scientific | 4053-8223Q | |
| Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Gel Breaker Tube 0.5 ml | IST Engineering Inc, | 3388-100 | |
| Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs | Biorad | 1704446 | |
| Glycoblue | Ambion | AM9516 | |
| Jersey-Cote | LabScientific, Inc | 1188 | |
| KcL 2M | Ambion | AM9640G | |
| MgCl2 1M | Ambion | AM9530G | |
| Minifuge dual rotor personal centrifuge | USA scientific | 2641-0016 | |
| Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers | Ciore Life Science | 21070010 | |
| Oligonucleotides | IDT | Defined during order | |
| Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs | Thermofisher Scientific | B2 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Restriction enzyme PmeI | NEB | R0560S | |
| RNase-free water | Ambion | AM9932 | |
| Safe Imager 2.0 | Life Technologies | G6600 | |
| Safe Imager 2.0 blue light transilluminator | Thermofisher | G6600 | |
| SeaKem LE agarose | Lonza | 50002 | |
| Superscript III reverse transcription kit | Invitrogen | 18080-044 | |
| SybrGold | Life Technologies | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 | NEB | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q | NEB | 0351L | |
| TEMED | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| Themocycler with heated lid | Applied Biosystem | 4359659 | |
| Tris 1M pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| Tris 1M pH8.0 | Ambion | AM9855G | |
| UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer | National Diagnostics | EC-833 |
References
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