Levator Auris Longus 포유류 신경 근육 학 전송 전압 클램프 조건에서의 시험을 위한 준비
Summary
이 문서에 설명 된 프로토콜 neuromuscular 접속점에 자발적인 기록 마우스 levator auris longus (LAL) 근육 및 신경 갖는 postsynaptic 잠재력 (전류 클램프)과 전류 (전압 클램프)를 사용 합니다. 이 기술 사용 하 여 정상과 질병 조건 하에서 시 냅 시스 전송의 기계 장치에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜 전류 클램프 및 클램프 전압 조건 하에서 신경 근육 학 교차로에서 기록 시 냅 스 전송 하는 기법을 설명합니다. Levator auris longus (LAL)의 비보 전 준비 때문에 모터 종판에서 합 문 microelectrode에 대 한 신경 근육 접합의 쉽게 시각화를 제공 하는 얇은 근육 사용 됩니다. 이 메서드는 자발적인 미니어처 종판 전위와 전류 (mEPPs 및 mEPCs), 신경 갖는 종판 잠재력 및 전류 (엡 스와 Epc)의 기록 뿐만 아니라 모터 종판 막 속성에 대 한 수 있습니다. 이 방법에서 얻은 결과 quantal 콘텐츠 (QC), 소포 자료 사이트 (n)의 수, 확률의 소포 자료 (p확인해), 시 냅 스 촉진 및 우울증, 근육 막 시간 상수 (τ 포함 m) 및 입력 저항. 인간 질병의 마우스 모델에이 기술 적용 질병 상태에 주요 병 리를 강조 하 고 새로운 치료 전략을 확인할 수 있습니다. 완전히 전압 클램핑 단일 시 냅 스에 의해이 제공 합니다 현재 사용할 수 있는 시 냅 시스 전송의 가장 상세한 분석의 하나.
Introduction
신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전송 공부 신경 및 골격 근육 시스템의 동적 관계에 통찰력을 제공 하 고 시 냅 스 생리학을 조사 하기 위한 우수한 모델입니다. Levator auris longus (LAL)은 얇은 근육, 쉽게 시각화에 신경 근육 접합부에 대 한 허용. 이전 보고서는 랄을 사용 하 여 시 냅 스 약물과 독 소를 검사 하 고 랄1,2의 골격 근육 섬유 유형 특성을 특징 하 편의 설명 했습니다. 수많은 연구는 신경 근육 학 생리학3,,45,6,7,8을 검사 하는 랄을 사용 했습니다. 전기 생리학, 랄 신경 근육 접합을 쉽게 관찰 하는 능력 모터 종판에 microelectrodes의 정확한 배치에 대 한 수 및 시 냅 스 전송 기록에 공간 클램프 문제를 크게 감소 시킨다. 전류 클램프 녹음 근육 막 속성 막 시간 상수 (τm) 및 (R에서에) 입력된 저항 등의 쉽게 얻을 수 있습니다. 또한, 이러한 속성은 신경 근육 학 전송, 시 냅 스 기능 근육 막 속성의 직접적인 비교에 대 한 수를 기록 하는 데 사용 하는 동일한 근육 섬유에서 측정할 수 있습니다. 이러한 데이터의 분석의 많은 신경 근육 학 질병 및 변경 된 활동의 상태 물리적 메커니즘에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
여기에 설명 된 기술의 핵심 요소는 비선형 전류 클램프에 적용 되지 않습니다 하 고 근육 막 속성의 독립은 시 냅 스 녹음에 대 한 전압 클램프의 사용 이다. 전류 클램프 반대 전압 클램프를 사용 하 여 신경 근육 학 전송 검사의 장점은 개척 1950 년대9에서 노력에 의해 설립 되었다. 전류 클램프에서 진폭에서 10-15 mV를 초과 하는 EPPs mEPP 진폭9의 선형 제품 않습니다. 예를 들어, 평균 mEPP 1 mV, 5의 EPP mV 5 mEPPs 5 (QC);의 제품으로 간주 수 있습니다 반면, 40의 EPP mV 이상의 40 mEPPs의 제품 될 것입니다. 이 비선형 큰 EPPs에 막 잠재력과 아 세 틸 콜린 수용 체에 대 한 평형 잠재력의 차이 EPP에 대 한 강제 운전 때문에 발생 (~-10 mV), 실질적으로 큰 EPPs는 동안 감소. 근육 막 잠재력 전압 클램프 실험 기간 동안 변경 되지 않습니다 때문에이 문제는 전압 클램프 실험에서 피할 수 있습니다. 결점은 전압 클램프 실험은 전류 클램프 녹음 보다 완료 하는 데 기술적으로 어렵습니다. 이 염두에서에 두고, McLachlan와 마틴 엡 스10의 전류 클램프 녹음에서 비선형 차지 간단 수학 교정 개발. 수정11,,1213, 잘 작동 하지만 중요 한 것은, 근육 막 속성 방해 하지는 가정.
근육 막 속성은 특히 공부 하는 조건 또는 질병 상태는 근육을 방해 하는 경우를 고려 하는 것이 중요 합니다. 예를 들어, Huntington의 질병의 R6/2 유전자 변형 모델에서 골격 근육 휴식 염화 칼륨 전류14,15에서 hyperexcitable 진보적인 감소 때문입니다. 결과적으로, mEPPs와 엡 스 R6/2 골격 근육에서 증폭 됩니다. 물론, 추가 요소는 mEPPs와 엡 스를 변경할 수 있습니다. 올 무-단백질8관련이 있을 듯 EPPs에 변화를 발견 Huntington의 질병 쥐는 (R6/1)의 다른 모델을 사용. 변경 된 신경 근육 학 전송을 일으키는 메커니즘을 평가 하는 전압 클램프를 사용 하 여 변경 된 근육 막 속성의 영향을 제거 도움이 것입니다. 최근 연구에서 R6/2 신경 근육 학 전송 여기 설명 된 기술을 사용 하 여 두 전류 및 전압 클램프 조건에서 연구 했다. 모터 종판 전체 종판16의 길이 상수 내에서 두 개의 microelectrodes를 배치 하 여 전압 고정으로 적은 1% 오류 보다 했다. 그것은 그 전압 클램프를 표시 했다 고 나왔고 R6/2 근육에 신경 근육 학 전송의 대조 측정 전류 클램프 레코드 수정. 이 근육 막 속성 변경 하는 경우 비선형에 대 한 엡 스를 해결 하는 것이 어려울 수 있습니다 강조 하 고 근육 막 속성의 독립적인 전압 클램프 레코드의 혜택을 보여줍니다. 여기에 소개 하는 프로토콜은 조건 또는 시 냅 스 전송 및 postsynaptic 막 속성에 영향을 주는 질병 상태를 검사 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 준비 및 신경 근육 학 전송 전류 또는 전압 클램프 조건 하에서 측정에 대 한 마우스 랄 근육의 사용 이다. 랄 개 해 부에 대 한 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 포인트가 있다. 전극으로 전극 합 문 근육 에이즈에서 초과 결합 조직 청소 때 합 문에 대 한 위치 결합 조직 퍼 가기 수 있습니다. 그러나, 멀리 취할 수 있는 결합 조직 제거 쉽게 근육 손상의 기회를 제한 하기. 그것은 매우 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 닥터 마크 M. 부자와 다니엘 미 란다 편집 의견, 아마 드 Khedraki이 기술, 그리고 라이트 주립 대학 재정 지원 (A.A.V. 시작 기금)에 대 한 설정 도움.
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
References
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