Levator Auris Longus Forberedelse til eksamen mammale neuromuskulære transmission spænding klemme betingelser
Summary
Den protokol, der er beskrevet i denne hvidbog bruger musen levator auris longus (LAL) muskel til at optage spontane og nerve-fremkaldte postsynaptiske potentialer (nuværende-klemme) og strøm (spænding-klemme) på den neuromuskulære junction. Brug af denne teknik kan give vigtig indsigt i mekanismer af synaptisk transmission under normal og sygdom.
Abstract
Denne protokol beskriver en teknik til at optage synaptisk transmission fra den neuromuskulære junction aktuelle-clamp og spænding-clamp betingelser. En ex vivo forberedelse af levator auris longus (LAL) bruges, fordi det er en tynd muskel, der giver nem visualisering af den neuromuskulære junction for mikroelektrode Spidning på pæl på den motor endplate. Denne metode giver mulighed for optagelse af spontan miniature endplate potentialer og strømme (mEPPs og mEPCs), nerve-evoked endplate potentialer og strømforhold (EPPs og EPCs), samt egenskaberne membran i den motor endplate. Resultaterne fra denne metode omfatter den quantal indhold (QC), antallet af vesikel frigivelse sites (n), sandsynligheden for vesikel release (prel), synaptic lettelse og depression samt muskel membran tid konstant (τ m) og input modstand. Anvendelse af denne teknik til musemodeller af sygdomme hos mennesker kan fremhæve vigtige patologier i sygdomstilstande og hjælpe med at identificere nye behandling strategier. Af fuldt spænding fastspænding en enkelt synapse, giver denne metode en af de mest detaljerede analyser af synaptisk transmission i øjeblikket tilgængelige.
Introduction
Studerer synaptisk transmission på den neuromuskulære junction giver et indblik i det dynamiske forholdet mellem de nervøse og skelet muskuløs systemer og er en fremragende model for behandlingen af synaptic fysiologi. Levator auris longus (LAL) er en tynd muskel, giver mulighed for de neuromuskulære knudepunkter til visualiseres nemt. Tidligere rapporter har beskrevet bekvemmeligheden for at bruge LAL at undersøge synaptic stoffer og toksiner og har karakteriseret skelet muskel fiber type Karakteristik af LAL1,2. Talrige undersøgelser har brugt LAL for at undersøge neuromuskulære fysiologi3,4,5,6,7,8. Elektrofysiologi, mulighed for at nemt observere LAL neuromuskulære knudepunkter giver mulighed for den nøjagtige placering af microelectrodes på de motoriske endplate og reducerer klemme rumspørgsmål i optagelse synaptisk transmission. Nuværende-clamp optagelser af egenskaberne muskel membran, membran tid konstant (τm) og input modstand (Ri) er let opnås. Desuden kan disse egenskaber måles fra de samme muskel fibre bruges til at registrere neuromuskulære transmission, giver mulighed for en direkte sammenligning af synaptiske funktion til muskel membran egenskaber. Analyse af disse data kan give indsigt i de fysiske mekanismer af mange neuromuskulære sygdomme og tilstande af ændret aktivitet.
Et centralt aspekt af den teknik beskrevet her er brugen af spænding-klemme til synaptic optagelser, som ikke er underlagt de ikke-linearities opstod i strøm-clamp og er uafhængige af muskel membran egenskaber. Fordele ved at bruge spænding-klemme i modsætning til aktuelle-klemme til at undersøge neuromuskulære transmission blev etableret af banebrydende indsats i 1950s9. Under aktuelle-clamp er EPPs, der overstiger 10-15 mV i amplitude ikke en lineær produkt af Mellemøsten amplitude9. For eksempel, hvis den gennemsnitlige Mellemøsten er 1 mV, en EPP 5 mV kan antages for at være produktet af 5 mEPPs (QC 5); der henviser til, et EPP 40 mV vil være et produkt af mere end 40 mEPPs. Denne ikke-linearitet på større EPPs opstår fordi drivkraft for PPE-gruppen, som er forskellen mellem membran potentiale og ligevægt potentiale for acetylcholin receptor (~ -10 mV), væsentligt falder under store EPPs. Dette problem undgås i spænding-clamp eksperimenter, fordi muskel membran potentiale ikke ændrer under spænding-clamp eksperimenter. En ulempe er, at spændingen-clamp eksperimenter er teknisk sværere at gennemføre end nuværende-clamp optagelse. Med dette i tankerne udviklet McLachlan og Martin en ligetil matematiske korrektion, der tegner sig for ikke-linearities i nuværende-clamp optagelser af EPPs10. Korrektionerne, der fungerer godt11,12,13, men vigtigere, antage, at muskel membran egenskaber ikke er blevet afbrudt.
Muskel membran egenskaber er især vigtigt at overveje, om at studere betingelser eller sygdomstilstande, der forstyrrer musklen. Skeletmuskulatur fra R6/2 transgene model af Huntington’s chorea er f.eks hyperexcitable på grund af en progressiv reduktion i hvilepuls chloride og kalium strømme14,15. Som en konsekvens, forstærkes mEPPs og EPPs i R6/2 skeletmuskulatur. Bestemt, yderligere faktorer kan ændre mEPPs og EPPs. Arbejde med en anden model af Huntington’s chorea-mus (R6/1) fandt ændringer i EPPs, der syntes at være relateret til SNARE-proteiner8. For at vurdere de mekanismer, der forårsager ændrede neuromuskulære transmission, ville det være gavnligt at fjerne virkningerne af ændrede muskel membran egenskaber ved hjælp af en spænding-klemme. I en nylig undersøgelse, var R6/2 neuromuskulære transmission studerede på både strøm og spænding klemme betingelser ved hjælp af den teknik beskrevet heri. Helhed af den motoriske endplates var spænding-fastspændt med mindre end 1% fejl ved at placere to microelectrodes inden for konstanten længde af endplate16. Det var vist spænding-clamp og korrigeret aktuelle-clamp poster givet kontrasterende målinger af neuromuskulære transmission i R6/2 muskel. Dette understreger, at det kan være svært at rette EPPs for ikke-linearities, hvis muskel membran egenskaber er blevet ændret og viser fordelene ved at opnå spænding-clamp poster, der er uafhængige af muskel membran egenskaber. Protokollen præsenteres heri er ideelle til at undersøge forhold eller sygdomstilstande, der påvirker synaptisk transmission og postsynaptiske membran egenskaber.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet her er forberedelse og brug af musen LAL muskel til måling af neuromuskulære transmission strøm eller spænding klemme betingelser. Der er flere vigtige punkter at overveje for dissekere ud LAL. Rengøring overskydende bindevæv fra muskler aids i elektrode Spidning på pæl, som elektroderne kan snag bindevæv, når positionering dem til Spidning på pæl. Dog kun fjerne bindevæv, der kan blive taget væk nemt at begrænse chancer for at beskadige musklen. Isolation af nerve bør udføres med omhu, fordi d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Mark M. Rich og Daniel Miranda for redaktionelle kommentarer, Ahmad Khedraki for støtte til oprettelse af denne teknik, og Wright State University for finansiel støtte (Start fond til A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
References
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neurosciences. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neurosciences. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
