Generación de células epiteliales nasales humanas esferoides para estudio de regulador de conductancia de la transmembrana individualizada la Fibrosis quística
Summary
Aquí se describe un método para generar culturas esferoide tridimensional de células epiteliales nasales humanas. Esferoides son estimulados luego a unidad de regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR)-ion dependiente y secreción flúida, cuantificar el cambio en el tamaño luminal esferoide como un proxy para la función CFTR.
Abstract
Mientras que la introducción del regulador de conductancia transmembrana (CFTR) Fibrosis Quística modulador medicamentos ha revolucionado el cuidado en la Fibrosis Quística (FQ), el modelo de la terapia dirigida de genotipo actualmente en uso tiene varias limitaciones. Grupos de primera, raras o escasamente mutación están excluidos de ensayos clínicos definitivos. Por otra parte, como drogas modulador podrá entran en el mercado, será difícil optimizar las opciones de modulador para un tema individual. Ambos problemas se tratan con el uso de sistemas modelo preclínico derivados del paciente, individualizado de la función CFTR y modulación. Las células epiteliales nasales humanas (HNEs) son una fuente accesible de tejido respiratorio de este modelo. Adjunto, describimos a la generación de un modelo esferoide tridimensional de la función CFTR y modulación usando HNEs primarias. HNEs están aislados de los sujetos de manera mínimamente invasiva, ampliado en condiciones de reprogramación condicionales y sembrado en la cultura del esferoide. Dentro de 2 semanas de la siembra, las culturas esferoide generan esferoides HNE que pueden ser estimulados con 3′, 5′-cíclico del monofosfato de adenosina (cAMP)-generación de agonistas para activar la función CFTR. Hinchazón del esferoide se cuantifica entonces como un proxy de la actividad CFTR. Esferoides HNE capitalizan el origen mínimamente invasivo, sin embargo, respiratorio de las células nasales para generar un modelo accesible, personalizado correspondiente a un epitelio que refleja la mortalidad y la morbilidad de la enfermedad. En comparación con las culturas de gran interfaz aire-líquido, esferoides son relativamente rápidos a madurar, que reduce la tasa de contaminación. En su forma actual, el modelo es limitado por bajo rendimiento, aunque esto es compensado por la relativa facilidad de adquisición de tejido. Esferoides HNE pueden utilizarse confiablemente cuantificar y caracterizar la actividad CFTR a nivel individual. Un estudio en curso hacer esta cuantificación en vivo respuesta fármaco determinará si esferoides HNE son un verdadero predictor preclínico de respuesta del paciente a la modulación de la CFTR.
Introduction
Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad recesiva fatal, de un autosoma que afecta a más de 70.000 personas en todo el mundo1. Esta enfermedad genética del vida-acortamiento es causada por mutaciones en la conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística regulador de la proteína (CFTR)2. CFTR es miembro de la familia de cassette de unión a trifosfato de adenosina y funciones como un canal iónico que permite el movimiento de cloruro y bicarbonato a través de las membranas apicales del epitelio polarizado múltiples incluyendo el tracto gastrointestinal, glándulas sudoríparas, y respiratoria del árbol, entre otros3,4. Como tal, disfuncional CFTR conduce a la disfunción epitelial del multisistema, con más mortalidad derivadas de la enfermedad respiratoria1. En el pulmón con FQ, pérdida de vía aérea basada en CFTR superficie líquido (ASL) regulación y moco lanzamiento conduce a moco espesado, obstrucción de las vías respiratorias, infección crónica y remodelación de vía aérea progresiva y pérdida de función de pulmón1,5.
A pesar de la identificación de la disfunción CFTR como la causa de la enfermedad, terapias en la FQ tradicionalmente centrado en la mitigación de los síntomas (p. ej., terapia de reemplazo de enzimas pancreáticas, terapias de limpieza de la vía aérea)1. Este enfoque recientemente fue revolucionado por la llegada de la nueva terapéutica, denominada “Moduladores CFTR,” que directamente CFTR disfuncional. Este enfoque ha cambiado el panorama clínico de manejo de los síntomas a modificadores de la enfermedad cuidado pero lleva varias limitaciones6,7,8,9,10. Actividad de modulador es específico para el defecto de la proteína que acompaña cada mutación de CFTR y limitada para seleccionar las poblaciones genético11. Esta limitación es conducida por la naturaleza heterogénea de los defectos de la proteína, sino también por la impracticalidad de ensayos clínicos en grupos de mutación rara. Además, entre los sujetos con genotipos estudiados (e.g., CFTR F508del/F508del, la mutación de CFTR más común), hay gran variabilidad en enfermedad carga y modulador de respuesta6,7,8 ,9,11.
Para superar ambos problemas, los investigadores han propuesto el uso de modelos personalizados para ensayos preclínicos12. Este concepto utiliza tejido específico para cada paciente para generar un sistema de modelo individualizado ex vivo para la prueba compuesta, predecir la en vivo tema respuesta a los tratamientos de forma personalizada. Una vez validado, este modelo podría utilizarse por los clínicos a la terapia de precisión de disco independientemente del genotipo CFTR subyacente del paciente.
Humano bronquial (HBE) las células epiteliales obtenidas del tejido del explante en el momento del trasplante de pulmón establecieron la posibilidad de tal modelo para CF13,14. HBE crecido en una interfase aire-líquido (ALI) permite la cuantificación de CFTR funcional directamente a través de la prueba electrophysiologic o indirectamente a través de medidas de ASL homeostasis13,15. Este modelo ha sido fundamental para entender la biología CFTR y fue un factor clave en el desarrollo de moduladores CFTR16. Desafortunadamente, los modelos HBE no son sostenible como un modelo personalizado debido a la naturaleza invasiva de adquisición (el trasplante de pulmón o cepillado bronquial) y falta de muestras para aquellos con mutaciones raras o enfermedad leve. Por el contrario, tejido intestinal, Obtenido de especímenes de la biopsia rectal o duodenal, puede utilizarse para que medición de corriente intestinal (ICM) o un ensayo de organoide basada en la inflamación al estudio individualizado CFTR función17,18, 19. ensayos de organoide, en particular, son modelos muy sensibles de la CFTR actividad20,21,22. Ambos modelos están limitados por la fuente de tejido (tejido intestinal, mientras la mayoría enfermedad patología respiratoria) y el método semi-invasivo de adquisición. Por otra parte, varios investigadores han estudiado humana nasal (HNE) las células epiteliales a modelo CFTR restauración23,24,25. HNEs pueden recolectarse con seguridad por el cepillo o el curetaje en sujetos de cualquier edad y, cuando se cultivan en ALI, recapitulan muchas características de HBE25,26,27,28. Cultivos monocapa de gran tradicionalmente han sido limitadas por transformación escamosa y mucho tiempo a madurez29. Además, cortocircuito medidas de corriente en HNEs son más pequeñas que ésos en HBEs, sugiriendo una ventana más pequeña para detectar la eficacia terapéutica25.
Dada la necesidad de un modelo de cultivo de tejidos personalizados, no invasivos, respiratorios de la función CFTR, intentamos combinar la sensibilidad de un ensayo de organoide basado en inflamación, con la naturaleza no invasiva y respiratoria de HNEs. Aquí, describimos nuestro método de generar culturas de 3 dimensiones “esferoide” de HNEs para estudio individualizado de CFTR en un ensayo basado en la inflamación de30. Esferoides HNE polarizan confiablemente con el ápice epitelial hacia el centro de la esfera, o lumen. Este modelo recoge numerosas características de un epitelio respiratorio inferior y madura más rápidamente que las culturas ALI. Como un análisis funcional, esferoides HNE cuantifican confiablemente una función gama de CFTR, así como la modulación en grupos bien estudiados de la mutación (por ejemplo, F508del CFTR). Este análisis basado en la inflamación aprovecha las propiedades de transporte iónico sal de CFTR, indirectamente medir flujo líquido en el esferoide como agua sigue sal apical de la emanación. De esta manera, esferoides estimulados con CFTR completamente funcional se hinchan robusta, mientras que aquellos con CFTR disfuncional hinchan menos o encogen. Esto se cuantifica a través de análisis de imagen de pre- y cambian de esferoides de estimulación después de 1 h, área luminal y determinar el por ciento. Esta medida se puede comparar entonces a través de grupos experimentales a la pantalla para la bioactividad de la droga de un modo específico para cada paciente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la generación de culturas de células nasales paciente esferoide capaces de producir un modelo individualizado, específico de la función CFTR. Hay varios pasos claves en el proceso que debe ser atendido cerca para evitar la dificultad. En primer lugar es una adquisición de buena muestra de la nariz del paciente. Una buena muestra debe tener > 50.000 células, limitada moco/escombros y estar listo para el procesamiento dentro de 4 h (aunque el éxito también es fácilmente alcanzable con enví…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Fibrosis quística, número CLANCY14XX0 y a través de la Fundación de Fibrosis quística, número CLANCY15R0 de la concesión. Los autores desean agradecer a Kristina Ray por su asistencia en el reclutamiento de pacientes y supervisión reguladora. Los autores también desean agradecer al grupo de trabajo de gran apoyado de la Fundación de Fibrosis quística, que ayudó en la generación de capacidades de gran cultura: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomón Marty y Katherine Tuggle.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
| 15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
| 1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
| 35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
| 50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
| Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
| Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
| Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
| Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
| IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
| Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
| Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
| Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
| Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
| Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |
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