Generatie van menselijke nasale epitheliale cel spheroïden voor geïndividualiseerde Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator studie
Summary
Hier beschrijven we een methode voor het genereren van driedimensionale sferoïde culturen van menselijke nasale epitheliale cellen. Spheroïden worden dan gestimuleerd naar station Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR)-afhankelijk van de ion en vloeistof secretie, kwantificeren van de verandering in de sferoïde luminal grootte als een proxy voor CFTR-functie.
Abstract
Terwijl de invoering van Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) modulator drugs heeft een revolutie teweeggebracht in zorg in Cystic Fibrosis (CF), heeft het genotype gerichte therapie model momenteel in gebruik verschillende beperkingen. Eerste, zeldzame of understudied mutatie groepen zijn uitgesloten van de definitieve klinische proeven. Bovendien, zoals extra modulator geneesmiddelen de markt betreden, het zal moeilijker geworden voor het optimaliseren van de modulator keuzes voor een individuele certificaathouder. Beide zaken worden behandeld met het gebruik van patiënt-afgeleid, geïndividualiseerde preklinische modelsystemen van CFTR-functie en modulatie. Menselijke nasale epitheliale cellen (HNEs) zijn een gemakkelijk toegankelijke bron van respiratoire weefsel voor een dergelijk model. Hierin beschrijven we de generatie van een driedimensionale sferoïde model van CFTR-functie en modulatie met behulp van primaire HNEs. HNEs zijn geïsoleerd van onderwerpen in een minimaal invasieve manier, uitgebreid in voorwaardelijke herprogrammering voorwaarden, en in de cultuur sferoïde agarvoedingsbodem. Binnen 2 weken na het zaaien, sferoïde culturen genereren HNE spheroïden die kunnen worden gestimuleerd met 3′, 5′-cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP)-het genereren van agonisten CFTR-functie te activeren. Sferoïde zwelling is dan gekwantificeerd als een proxy voor CFTR-activiteit. HNE spheroïden kapitaliseren op de minimaal invasieve echter respiratoire oorsprong van nasale cellen voor het genereren van een toegankelijke, gepersonaliseerde model relevant zijn voor een epitheel die als gevolg van ziekte morbiditeit en mortaliteit. Vergeleken met de air-liquide interface HNE culturen, zijn spheroïden relatief snel te rijpen, die vermindert de totale verontreiniging tarief. In zijn huidige vorm, wordt het model beperkt door lage doorvoersnelheid, maar dit wordt gecompenseerd door het relatieve gemak van weefsel overname. HNE spheroïden kunnen worden gebruikt om betrouwbaar kwantificeren en karakteriseren CFTR activiteit op het individuele niveau. Een lopend onderzoek te binden deze kwantificering in vivo drug antwoord zal bepalen of HNE spheroïden een ware preklinische voorspeller van patiënt reactie op CFTR modulatie zijn.
Introduction
Cystic Fibrosis (CF) is een fatale, autosomaal recessieve ziekte die meer dan 70.000 mensen wereldwijd1. Deze leven-verkorting genetische ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in de Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator eiwit (CFTR)2. CFTR is een lid van de familie van adenosinetrifosfaat-binding cassette, en functies als ionkanaal waardoor verkeer van chloride en bicarbonaat in de apicale membraan van meerdere gepolariseerde epitheel, met inbegrip van het maag-darmkanaal, zweetklier, en respiratoire tree, o.a.3,4. Als zodanig, leidt disfunctionele CFTR naar Multisysteem epitheliale dysfunctie, met de meeste sterfte als gevolg van de respiratoire ziekte1. In de CF Long, verlies van CFTR-gedreven airway oppervlakte vloeibare (ASL) verordening en slijm release leidt tot verdikt slijm, obstructie, chronische infectie, en progressieve airway remodeling alsmede van1,5van de functie van de longen.
Ondanks de identificatie van CFTR dysfunctie als de oorzaak van de ziekte, therapieën in CF oudsher gericht op mitigatie van symptomen (bijv, alvleesklier enzym substitutietherapie, luchtweg klaring therapieën)1. Deze aanpak werd onlangs een revolutie door de komst van nieuwe therapeutics, genoemd “CFTR modulatoren,” die rechtstreeks gericht zijn op disfunctionele CFTR. Deze aanpak is de klinische landschap verschoven van symptoom beheer naar ziekte-aanpassen verzorgen maar draagt verschillende beperkingen6,7,8,9,10. Modulator activiteit is specifiek voor het eiwit defect begeleidende elke CFTR-mutatie en beperkt tot het selecteren van genetische populaties11. Deze beperking wordt gedreven door het heterogene karakter van eiwit gebreken, maar ook door de onuitvoerbaarheid van klinische proeven in zeldzame mutatie groepen. Daarnaast, onder onderwerpen met goed bestudeerde genotypen (b.v., F508del/F508del CFTR, de meest voorkomende CFTR-mutatie), is er grote variabiliteit in ziekte lasten en modulator reactie6,,7,8 ,9,11.
Om te overwinnen beide zaken, hebben onderzoekers voorgesteld het gebruik van de gepersonaliseerde modellen voor preklinische testen12. Dit concept maakt gebruik van patiënt-specifieke weefsel voor het genereren van een geïndividualiseerde ex vivo modelsysteem voor het testen van de samengestelde, het voorspellen van in vivo onderwerp reactie op therapieën op een persoonlijke manier. Eenmaal gevalideerd, kan een dergelijk model worden gebruikt door clinici naar station precisie therapie ongeacht het onderliggende CFTR genotype van de patiënt.
Menselijke bronchiale epitheliale (HBE) cellen explant weefsel verkregen op het tijdstip van Long transplantatie opgericht de mogelijkheid van een dergelijk model voor CF13,14. HBEs geteeld op een lucht-vloeistof-interface (ALI) is voorzien van functionele CFTR kwantificering rechtstreeks via het electrophysiologic testen, of indirect via maatregelen van ASL homeostase13,15. Dit model is cruciaal geweest voor het begrip CFTR biologie en was een belangrijke stimulans in de ontwikkeling van CFTR modulatoren16. HBE modellen zijn helaas niet houdbaar als een gepersonaliseerde model vanwege het invasieve karakter van verkrijging (Long transplantatie of bronchiale borstelen) en het ontbreken van monsters voor mensen met zeldzame mutaties of milde ziekte. Omgekeerd, intestinale weefsel, verkregen uit rectale of duodenale biopsie monsters, kan worden gebruikt voor intestinale Stroommeting (ICM) of een zwelling gebaseerde organoid assay te bestuderen van geïndividualiseerde CFTR functie17,18, 19. Organoid tests, in het bijzonder zijn zeer gevoelige modellen van CFTR activiteit20,21,22. Beide modellen zijn beperkt door de weefsel bron (intestinale weefsel, terwijl de meeste ziekte pathologie respiratoire is) en de semi-invasieve methode van overname. U kunt ook hebben verschillende onderzoekers bestudeerd menselijke nasale epitheliale cellen van het (HNE) tot model CFTR restauratie23,24,25. HNEs veilig geoogst kan worden met de borstel of curettage in onderwerpen van elke leeftijd en wanneer gekweekt in ALI, recapituleren veel kenmerken van HBEs25,26,27,28. HNE enkelgelaagde culturen hebben traditioneel beperkt gebleven door squamous transformatie en een lange tijd tot en met29van de looptijd. Bovendien gemeld kortsluiting huidige metingen in HNEs zijn kleiner dan die in HBEs, een kleiner venster te sporen therapeutische werking25suggereren.
Gezien de behoefte aan een persoonlijke, niet-invasieve respiratoire weefselkweek model van CFTR-functie, die wij willen samenvoegen van de gevoeligheid van een zwelling gebaseerde, organoid assay met de niet-invasieve en respiratoire aard van HNEs. Hier beschrijven we onze methode voor de opwekking van 3-dimensionale “sferoïde” culturen van HNEs voor geïndividualiseerde CFTR-studie in een zwelling gebaseerde assay-30. HNE spheroïden polariseren betrouwbaar met de epitheliale apex richting het centrum van het gebied, of lumen. Dit model recapituleert vele kenmerken van een lagere respiratoire epitheel en rijpt sneller dan ALI culturen. Als een functionele assay kwantificeren HNE spheroïden betrouwbaar een bereik van CFTR-functie, evenals de modulatie in goed bestudeerde mutatie groepen (bijvoorbeeld, F508del CFTR). Deze zwelling gebaseerde assay speelt in op de ion/zout vervoer eigenschappen van CFTR, niet indirect meten vloeistof toestroom in de sferoïde als water apicale zout efflux volgt. Op deze wijze zwellen gestimuleerd spheroïden met volledig functionele CFTR krachtig, terwijl die met disfunctionele CFTR minder zwellen of krimpen. Dit wordt gekwantificeerd door beeldanalyse van pre- en 1 h na stimulatie spheroïden, luminal oppervlakte te meten en het bepalen van het percentage wijzigen. Deze maatregel kan vervolgens worden vergeleken tussen de experimentele groepen aan het scherm voor drug topicale in een patiënt-specifieke mode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de generatie van patiënt-afgeleide nasale sferoïde celculturen kunnen produceren een geïndividualiseerde, specifieke model van CFTR-functie. Er zijn verscheidene belangrijke stappen in het proces dat moet nauw worden bijgewoond om te voorkomen dat problemen. Ten eerste is de verwerving van een goed voorbeeld uit de neus van de patiënt. Een goed voorbeeld moeten > 50.000 cellen, slijm/puin beperkt en worden klaar voor verwerking binnen 4 uur (hoewel succes ook gemakkelijk haalbaar met overnacht…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door Cystic Fibrosis Stichting Therapeutics, nummer CLANCY14XX0 te verlenen en door middel van Cystic Fibrosis Stichting, verlenen nummer CLANCY15R0. De auteurs bedank Kristina Ray voor haar hulp bij de patiënt werving en regelgevend toezicht. De auteurs ook bedank de werkgroep HNE, ondersteund door de Cystic Fibrosis Stichting, die bijgestaan in de generatie van HNE cultuur mogelijkheden: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Solomon en Katherine Tuggle.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
| 15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
| 1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
| 35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
| 50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
| Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
| Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
| Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
| Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
| IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
| Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
| Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
| Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
| Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
| Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |
References
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
- Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
- Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
- . . CFTR2 Database. , (2017).
- Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O’Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
- Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
- Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
- van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
- Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
- Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
- Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
- Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
- Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
- Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).
