Nous décrivons ici une méthode pour générer des cultures sphéroïde en trois dimensions des cellules épithéliales nasales humaines. Sphéroïdes sont alors stimulés au lecteur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-ion charge et sécrétion de liquide, quantifier le changement de la taille de luminal sphéroïde comme approximation de fonction CFTR.
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Article de méthode
Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude
Dans cet article
Résumé
Résumé
Alors que l’introduction de médicaments modulateur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) a révolutionné les soins dans la fibrose kystique (FK), le modèle de thérapie axée sur le génotype en cours d’utilisation présente plusieurs limites. Groupes de mutation premier, rares ou peu étudiée sont exclus des essais cliniques définitives. En outre, comme drogues de modulateur supplémentaires entrer sur le marché, il deviendra difficile d’optimiser les choix de modulateur pour un sujet individuel. Ces deux problèmes sont abordés avec l’utilisation de systèmes individualisés, dérivé de patient modèle préclinique de fonction CFTR et modulation. Cellules épithéliales nasales humaines (HNEs) constituent une source facilement accessible du tissu respiratoire pour un tel modèle. Ici, nous décrivons la génération d’un modèle tridimensionnel sphéroïde de fonction CFTR et modulation en utilisant HNEs primaires. HNEs sont isolés des sujets de façon mini-invasive, élargi dans les conditions de reprogrammation conditionnelles et ensemencé dans la culture de l’ellipsoïde. Dans les 2 semaines des semis, cultures de sphéroïde génèrent des sphéroïdes HNE qui peuvent être stimulés avec 3', 5'-l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc)-générer des agonistes pour activer la fonction CFTR. Gonflement de sphéroïde est ensuite quantifié comme indicateur d’activité CFTR. Sphéroïdes HNE capitaliser sur l’origine peu invasive, mais respiratoire de cellules nasales pour générer un modèle accessible, personnalisé, pertinent à un épithélium reflétant la mortalité et la morbidité de la maladie. Par rapport aux cultures HNE interface air-liquide, sphéroïdes sont relativement rapides à maturité, ce qui réduit le taux global de contamination. Dans sa forme actuelle, le modèle est limité par un débit faible, mais cela est compensé par la facilité d’acquisition de tissu. Sphéroïdes HNE permet de quantifier et de caractériser l’activité CFTR au niveau individuel de façon fiable. Une étude en cours de lier cette quantification à in vivo la réaction aux médicaments déterminera si les sphéroïdes HNE sont un vrai prédicteur préclinique de la réponse du patient à la modulation de CFTR.
Introduction
Fibrose kystique (FK) est une maladie récessive autosomique fatale affectant plus de 70.000 personnes dans le monde1. Cette maladie génétique de la vie-raccourcissement est dû à des mutations la Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) de protéines2. CFTR est membre de la famille de triphosphate d’adénosine-binding cassette et fonctions comme un canal ionique permettant le mouvement du chlorure et du bicarbonate à travers les membranes apicales de l’épithélium polarisé multiples, y compris le tube digestif, glandes sudoripares, respiratoire et des arbres, entre autres3,
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Protocole
Échantillons de l’HNE ont été achetés auprès de sujets recrutés par le Cincinnati Children Hospital Medical Center CF Research Center. Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Institutional Review Board (IRB) de Cincinnati Children Hospital Medical Center. Consentement a été obtenu de tous les sujets avant le test.
1. préparer les médias de l’Expansion et antibiotiques
- Rassembler les composantes médias énumérés au tableau 1. Décongeler des surgelés matériaux à température ambiante et faire des solutions courantes nécessaires comme indiqué au tableau 1 en vertu de le « Expansion Med....
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Résultats
HNEs devrait fixer à la boîte de Petri et forment des îlots de cellules dans les 72 h d’ensemencement ; exemples de formation de l’île de bonne et mauvaise à une semaine sont présentés dans la Figure 1bis et 1 b, respectivement. Ces îles doivent se développer pour couvrir le plat au cours de 15 à 30 jours. Petits ou sous-optimal des échantillons peuvent prendre plus de temps et souvent ne donneront pas utiles sphéroïdes. Contamination par des.......
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Discussion
Ce protocole décrit la génération dérivé de patient nasal sphéroïde de cultures de cellules capables de produire un modèle de fonction CFTR individualisé, spécifique. Il y a plusieurs étapes clés dans le processus qui doit être étroitement assisté pour éviter les difficultés. Tout d’abord est une acquisition bon échantillon du nez du patient. Doit avoir un bon échantillon > 50 000 cellules, limitée glaire/débris et être prêt pour le traitement de moins de 4 h (même si le succès est aussi facilement réalisable avec nuit e.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, octroyer le numéro CLANCY14XX0 et par le biais de la Fondation de la fibrose kystique, octroyer le numéro CLANCY15R0. Les auteurs tiennent à remercier Kristina Ray pour son aide dans le recrutement de patients et de la surveillance réglementaire. Les auteurs tiennent également à remercier le groupe de travail HNE, soutenu par la Fondation de la fibrose kystique, qui ont aidé à la génération des capacités de culture HNE : Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomon Marty et Katherine Tuggle.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube Eppendorf de 1,5 ml | USA Scientific ; | 4036-3204 | |
| Fiole filtrante de 150 mL | Midsci ; | TP99150 | Pour filtrer le média |
| 15 mL Tube conique | Midsci ; | ||
| Flacon filtrant de 1 l | à mi-parcours | TP99950 | Média filtrant Antenne |
| parabolique à fond de verre de 35 mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| 3-Isobutyl-1-Méthylxanthine (IBMX) | optionFisher Scientific ; | AC228420010 | Préparez une solution mère de 100 mM de 22,0 mg dans 1 mL de DMSO |
| 50 mL Tube conique | Midsci ; | ; | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Solution de détachement cellulaire |
| Adénine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | Voir le tableau 1 |
| Amphotéricine B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Voir le tableau 1 |
| Extrait de cerveau bovin (9mg/mL) | Lonza ; | CC-4098 | Voir le tableau 2 |
| Hydrate de ceftazidime | Sigma-Aldrich | C3809-1G | Voir le tableau 1 |
| Racleurs cellulaires 20 cm ; | Midsci ; | ||
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Préparez une solution mère de 10 mM de 4,0 mg dans 1 mL de DMSO |
| Toxine cholérique B (de Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | Voir le tableau 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Brosse de cytologie |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Média Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)/F12 Hepes ; | Technologies de la vie ; | 11330-057 | Base Moyenne ; Voir tableaux 1 et 2 |
| Facteur de croissance épidermique (protéine humaine recombinante, sans origine animale) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | Voir tableau 1 |
| Épinéphrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | Voir Tableau 2 |
| Éthanol | Fisher Scientific ; | 2701 | |
| Éthanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16,6 mM solution ; Voir le tableau 2 |
| Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) | TCI America ; | E0084 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS haute performance) | Invitrogen ; | 10082147 | Voir le tableau 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Préparez une solution mère de 10 mM de 4,1 mg dans 1 mL de DMSO |
| Growth-Factor Shrink | Matrigel Corning, Inc. | 356231 | Matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit (DFG) de Corning, sans rouge de phénol, sans LDV, 10 mL. |
| Hémacytomètre | Hausser Scientific | 1483 | |
| Solution de collagène humain, type I (VitroCol ; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Solution de collagène |
| HyClone (alias FetalClone II) ; | GE Healthcare ; | SH30066.03HI | Voir le tableau 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | Voir les tableaux 1 et 2 |
| Insuline recombinante humaine, solution de zinc | Life Technologies ; | 12585014 solution à 4 mg/mL ; voir le tableau 2 | |
| Boîte de FIV à 4 puits, | NUNC non traité (via Fisher Scientific) | 12566350 | plaque à 4 puits pour les sphéroïdes ; taille de puits similaire à une plaque à 24 puits |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Fibroblastes embryonnaires murins irradiés |
| Metamorph 7.7 | Dispositifs | moléculairesLogiciel d’analyse ; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software pour un devis | |
| Olympus IX51 Microscope inversé | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Remplacement : Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ ; pour un devis |
| Pen Strep | Life Technologies ; | 15140122 | Voir le tableau 2 |
| Phsophoryléthéanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | Voir le tableau 2 |
| Acide rétinoïque | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Voir le tableau 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Curette nasale |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Logiciel d’imagerie abandonné. Remplacement : Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook pour un devis | |
| Saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Eau stérile | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Plat de culture tissulaire 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Plat de culture tissulaire pour expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | Voir le tableau 1 |
| Transferrine (Transferrine humaine 0,5 mL) | Lonza ; | CC-4205 | Voir le tableau 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3&prime ;,5-Triiodo-L-thyronine sel sodique ; [T3] ; Voir le tableau 2 |
| Trypsine du pancréas porcin | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL de poudre lypophilisée ; Voir le tableau 2 |
| Chlorhydrate de vancomycine de Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | Voir le tableau 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Préparer une solution mère de 1 mM de 0,4 mg dans 1 mL de DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Acheter ou préparer une solution mère de 10 mM de 4,5 mg dans 1 mL de chlorhydrate de DMSO |
| Y-27632 ; Inhibiteur de ROCK ; | Enzo LifeSciences ; | ALX-270-333-M025 ; | Voir le tableau 1 |
Références
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al.
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Réimpressions et autorisations
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