Her beskriver vi en metode for å generere tredimensjonalt formet kulturer av menneskelig nese epitelceller. Spheroids deretter stimulert til stasjonen cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator (CFTR)-avhengige ion og væske sekresjon, kvantifisere endringen i spheroid luminal størrelsen som en proxy for CFTR funksjon.
Mens innføring av cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator (CFTR) modulator narkotika har revolusjonert omsorg i cystisk fibrose (CF), har genotype rettet terapi modellen er i bruk flere begrensninger. Første, sjeldne eller lite studert mutasjon grupper utelates fra definitive kliniske studier. Videre, som ekstra modulator narkotika inn markedet, vil det bli vanskelig å optimalisere modulator valgene for en enkelt emne. Begge disse problemene er adressert med bruk av pasient-avledede, individualisert prekliniske modellsystemer av CFTR funksjon og modulering. Menneskelige nese epitelceller (HNEs) er en lett tilgjengelig åndedretts vev for slik modell. Her beskriver vi generering av en tredimensjonal spheroid modell av CFTR funksjon og moduleringshjul bruker primære HNEs. HNEs er isolert fra fag i en minimalt invasiv måte, utvidet i betinget omprogrammering forhold, og sådd i spheroid kulturen. Innen 2 uker til såing, formet kulturer generere HNE spheroids som stimuleret med 3′, 5′-sykliske adenosin monofosfat (cAMP)-generere agonister aktiverer CFTR-funksjonen. Spheroid hevelse er deretter kvantifisert som en proxy av CFTR aktivitet. HNE spheroids kapitalisere på minimal invasiv, men åndedretts opprinnelsen til nasal celler til å generere en tilgjengelig, personlige modell relevant for en epitel reflekterer sykdom sykelighet og dødelighet. Sammenlignet med luft-flytende grensesnitt HNE kulturer, er spheroids relativt rask modne, noe som reduserer den totale forurensning hastigheten. I sin nåværende form, er modellen begrenset av lav overføringshastighet, men dette er oppveid av relativt enkel vev oppkjøpet. HNE spheroids kan brukes til å pålitelig kvantifisere og karakterisere CFTR aktivitet på individnivå. En pågående studie å knytte denne kvantifisering i vivo narkotika svar vil avgjøre hvis HNE spheroids er en sann prekliniske prediktor for pasient svar CFTR modulering.
Cystisk fibrose (CF) er en dødelig, autosomalt recessiv sykdom påvirker over 70.000 mennesker over hele verden1. Dette livet-forkorte genetisk sykdom er forårsaket av mutasjoner i den cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator protein (CFTR)2. CFTR er medlem av adenosin trifosfat bindende kassett familien, og funksjoner som en ion kanal tillater bevegelse av klorid og bikarbonat over apikale membraner av flere polarisert epithelia inkludert mage-tarmkanalen, svette kjertel, og respiratoriske treet, blant annet3,4. Som sådan, fører dysfunksjonelle CFTR til multisystem epithelial dysfunksjon, med de fleste dødelighet stammer fra luftveissykdommer1. I CF lungene, tap av CFTR-drevet airway overflaten flytende (Oh) regulering og Slim release fører til tykkere slim, luftveisobstruksjon, kronisk infeksjon, og progressiv airway remodeling og tap av lunge funksjonen1,5.
Til tross for identifisering av CFTR dysfunksjon som forårsaker sykdom terapi i CF tradisjonelt fokusert på klimatiltak symptomer (f.eks, bukspyttkjertelen enzym erstatning terapi, airway klaring terapi)1. Denne tilnærmingen ble nylig revolusjonert av advent av romanen therapeutics, kalt “CFTR modulatorer,” som direkte mot dysfunksjonelle CFTR. Denne tilnærmingen har flyttet klinisk landskapet fra symptom ledelse til endring av sykdom omsorg men bærer flere begrensninger6,7,8,9,10. Modulator aktivitet er spesifikke for protein feilen følger hvert CFTR mutasjon og begrenset å velge genetiske bestander11. Denne begrensningen er drevet av heterogene natur protein defekter, men også av upraktisk av kliniske studier i sjeldne mutasjon grupper. I tillegg emner med godt studert genotyper (f.eksF508del/F508del CFTR, den vanligste CFTR mutasjonen), er det bred variasjon i sykdom byrde og modulator svar6,7,8 ,9,11.
For å overvinne begge disse problemene, har etterforskere foreslått bruk av personlige modeller for prekliniske tester12. Dette konseptet benytter pasient-spesifikke vev for å generere en individualisert ex vivo modellsystem for sammensatte testing, forutsi i vivo emnet respons på behandling på en personlig måte. Når godkjent, kan slik modell brukes av klinikere å kjøre presisjon terapi uansett pasientens underliggende CFTR genotype.
Menneskelige bronkial (HBE) epitelceller innhentet fra explant vev ved lungetransplantasjon etablert muligheten for slik modell for CF13,14. HBEs dyrket ved et luft-flytende grensesnitt (ALI) tillate funksjonelle CFTR kvantifisering direkte gjennom electrophysiologic testing, eller indirekte gjennom tiltak ASL homeostase13,15. Denne modellen har vært avgjørende for å forstå CFTR biologi og var en sentral pådriver i utviklingen av CFTR modulatorer16. Dessverre er HBE modeller ikke troverdig som en personlig modell invasiv art på (lungetransplantasjon eller bronkial penselen) og mangel på prøver for de med sjeldne mutasjoner eller mild sykdom. Derimot kan tarmen tissue, fra endetarms eller duodenal biopsi prøver, brukes for intestinal gjeldende måling (ICM) eller en hevelse-baserte organoid analysen for å studere individualisert CFTR funksjonen17,18, 19. Organoid analyser, spesielt er svært følsomme modeller av CFTR aktivitet20,21,22. Begge modellene er begrenset av vev kilden (tarmen tissue, mens de fleste sykdom patologi er åndedretts) og semi invasiv metode for oppkjøpet. Eventuelt har flere etterforskere studert menneskelige nese (HNE) epitelceller modell CFTR restaurering23,24,25. HNEs kan høstes trygt med pensel eller utskrapning i fag i alle aldre og når kultivert i ALI, recapitulate mange egenskaper HBEs25,26,27,28. HNE monolayer kulturer har tradisjonelt vært begrenset av plateepitel transformasjon og lang tid forfall29. Dessuten rapporterte kortslutt gjeldende mål i HNEs er mindre enn de i HBEs, foreslå et mindre vindu å oppdage terapeutiske effekten25.
Gitt behovet for en personlig, ikke-invasiv, luftveier vev kultur modell av CFTR funksjonen, forsøkte vi å flette følsomheten til en hevelse-basert, organoid analysen med HNEs ikke-invasiv og respiratoriske natur. Her beskriver vi vår metode generere 3-dimensjonale “formet” kulturer av HNEs for individuell CFTR studier i en hevelse-baserte analysen30. HNE spheroids polarize pålitelig med epithelial apex mot sfære senter, eller lumen. Denne modellen viser mange kjennetegner en nedre luftveier epitel og modnes raskere enn ALI kulturer. Som en funksjonell analysen kvantifisere HNE spheroids pålitelig en rekkevidde av CFTR funksjonen, samt moduleringshjul i godt studert mutasjon grupper (f.eksF508del CFTR). Denne hevelse-baserte analysen kapitaliserer på ion/salt transport egenskapene for CFTR, indirekte måle væske tilstrømningen til formet som vann følger apikale salt middelklasseinnbyggere. På denne måten, stimulert spheroids med funksjonell CFTR svelle robust, mens de med dysfunksjonelle CFTR hovne mindre eller krymper. Dette er kvantifisert gjennom bildeanalyse av før og 1 time etter stimulering spheroids, måler luminal området og bestemme prosent endre. Dette tiltaket kan deretter sammenlignes over eksperimentell grupper til skjermen for narkotika bioactivity på en pasient-spesifikk måte.
Denne protokollen beskriver generering av pasient-avledede nese formet cellekulturer kunne produsere en individualisert, bestemt modell av CFTR-funksjonen. Det er flere viktige trinn i prosessen som skal være tett deltok for å unngå problemer. Først er en god prøven oppkjøp fra pasientens nesen. Et godt eksempel bør ha > 50 000 celler, begrenset Slim/rusk, og være klar for behandling innen 4 timer (men suksess er også lett oppnåelig med overnatting shipping på is). Praksis å anskaffe prøver med curette eller…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av cystisk fibrose Foundation Therapeutics, gi nummer CLANCY14XX0 og gjennom cystisk fibrose Foundation, gi nummer CLANCY15R0. Forfatterne ønsker å takke Kristina Ray for henne hjelp i pasient rekruttering og regulatoriske forglemmelse. Forfatterne også ønsker å takke HNE working group, støttet av cystisk fibrose Foundation, som hjalp i generasjon av HNE kultur: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Salomo og Katherine Tuggle.
1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |