Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato
Summary
Qui descriviamo un metodo per generare colture sferoide tridimensionale di cellule epiteliali nasali umane. Sferoidi quindi sono stimolati a regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) in auto-dipendente dello ione e secrezione fluida, quantificare il cambiamento nella dimensione del luminal sferoide come proxy per funzione CFTR.
Abstract
Mentre l’introduzione di farmaci modulatore regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) ha rivoluzionato la cura nella fibrosi cistica (CF), il modello di terapia genotipo-diretta attualmente in uso presenta diverse limitazioni. Gruppi di mutazione prima, rare o understudied sono esclusi dagli studi clinici definitivi. Inoltre, come farmaci aggiuntivi modulatore entrino sul mercato, sarà difficile ottimizzare le scelte di modulatore per un singolo soggetto. Entrambe le questioni sono affrontate con l’uso di sistemi modello preclinico paziente-derivato, individualizzato di funzione CFTR e modulazione. Cellule epiteliali nasali umane (HNEs) sono una fonte facilmente accessibile del tessuto respiratorio per tale modello. Qui, descriviamo la generazione di un modello tridimensionale della sferoide di funzione CFTR e modulazione utilizzando HNEs primario. HNEs sono isolati da soggetti in modo minimamente invasivo, ampliato in condizioni di riprogrammazione condizionale e seminato nella cultura della sferoide. Entro 2 settimane dalla semina, culture sferoide generano sferoidi HNE che possono essere stimolate con 3′, 5′-adenosina monofosfato ciclico (cAMP)-generazione di agonisti per attivare la funzione CFTR. Gonfiore della sferoide è poi quantificato come proxy dell’attività CFTR. Sferoidi HNE capitalizzano l’origine come minimo dilagante, eppure respiratorio delle cellule nasali per generare un modello personalizzato, accessibile pertinente ad un epitelio che riflette la mortalità e la morbosità di malattia. Rispetto per le culture HNE interfaccia aria-liquido, sferoidi sono relativamente veloce per maturare, che riduce il tasso di contaminazione globale. Nella sua forma attuale, il modello è limitato dalla bassa velocità effettiva, anche se questo è compensata dalla relativa facilità di acquisizione del tessuto. Sferoidi HNE possono essere utilizzati per quantificare e caratterizzare l’attività CFTR a livello individuale in modo affidabile. Uno studio in corso per legare questa quantificazione di risposta ai farmaci in vivo stabilirà se sferoidi HNE sono un vero preclinico preannunciatore della risposta del paziente alla modulazione di CFTR.
Introduction
La fibrosi cistica (CF) è una malattia fatale, autosomica recessiva riguardano oltre 70.000 persone in tutto il mondo1. Questa malattia genetica di vita-riduzione è causata da mutazioni nella conduttanza del Transmembrane di fibrosi cistica regolatore della proteina (CFTR)2. CFTR è un membro della famiglia vassoio Trifosfato di adenosina-legante e funzioni come un canale ionico che permette il movimento del cloruro e bicarbonato attraverso le membrane apicali di epiteli polarizzati multiple compreso il tratto gastrointestinale, della ghiandola di sudore, respiratorio e albero, tra gli altri3,4. Come tale, disfunzionale CFTR conduce alla disfunzione epiteliale multisistemica, con maggior mortalità derivante dalla malattia respiratoria1. Nel polmone CF, perdita di CFTR-driven delle vie respiratorie superficie liquida (ASL) regolamento e muco rilascio porta a muco ispessito, ostruzione delle vie respiratorie, infezione cronica e rimodellamento delle vie respiratorie progressiva e perdita di funzione polmonare1,5.
Nonostante l’identificazione della disfunzione CFTR come la causa della malattia, terapie in CF tradizionalmente focalizzato sulla mitigazione dei sintomi (ad esempio, la terapia sostitutiva enzimatica pancreatica, terapie di clearance delle vie aeree)1. Questo approccio è stato recentemente rivoluzionato dall’avvento di nuove terapie, definita “Modulatori CFTR,” che incidono direttamente CFTR disfunzionale. Questo approccio ha spostato il paesaggio clinico da gestione dei sintomi a modificante la malattia cura ma comporta diverse limitazioni6,7,8,9,10. Attività di modulatore è specifico per il difetto di proteina che accompagna ogni mutazione CFTR e limitato a selezionare popolazioni genetiche11. Questa limitazione è guidata dalla natura eterogenea dei difetti di proteina, ma anche dall’impraticabilità delle sperimentazioni cliniche in gruppi di rara mutazione. Inoltre, fra gli oggetti con ben studiati genotipi (ad es., CFTR F508del/F508del, la più comune mutazione CFTR), c’è ampia variabilità nella malattia onere e modulatore risposta6,7,8 ,9,11.
Per risolvere entrambi i problemi, gli investigatori hanno proposto l’utilizzo di modelli personalizzati per test preclinici12. Questo concetto utilizza tessuto paziente-specifico per generare un sistema individualizzato ex vivo modello per test composto, predizione in vivo soggetto risposta alle terapie in modo personalizzato. Una volta convalidato, un tale modello potrebbe essere utilizzato dai clinici alla terapia di precisione di unità indipendentemente dal genotipo CFTR sottostante del paziente.
Cellule epiteliali bronchiali umane (HBE) ottenute da espianto dei tessuti al momento del trapianto di polmone stabilito la possibilità di un tale modello per CF13,14. HBEs cresciuta a un’interfaccia aria-liquido (ALI) permettono per la quantificazione di CFTR funzionale direttamente attraverso la prova electrophysiologic o indirettamente attraverso misure di ASL omeostasi13,15. Questo modello è stato fondamentale per comprendere la biologia CFTR e fu un fattore chiave nello sviluppo di CFTR modulatori16. Purtroppo, i modelli HBE non sono tenable come un modello personalizzato a causa della invasività di acquisizione (trapianto di polmone o spazzolatura bronchiale) e la mancanza di campioni per quelli con mutazioni rare o malattia delicata. Viceversa, tessuto intestinale, ottenuto da campioni di biopsia rettale o duodenale, possa essere utilizzato per la misura di corrente intestinale (ICM) o un’analisi basata su gonfiore organoid allo studio individualizzato CFTR funzione17,18, 19. Organoid saggi, in particolare, sono molto sensibili modelli del CFTR attività20,21,22. Entrambi i modelli sono limitati dalla fonte di tessuto (tessuto intestinale, mentre la maggior parte delle patologia di malattia respiratoria) e il metodo semi-invasivo di acquisizione. In alternativa, parecchi ricercatori hanno studiato nasale cellule epiteliali umane di (HNE) al modello CFTR restauro23,24,25. HNEs possono essere raccolte in modo sicuro a pennello o il curettage in soggetti di qualsiasi età e, quando coltivate in ALI, ricapitolare molte caratteristiche del HBEs25,26,27,28. Colture monostrato HNE tradizionalmente sono stati limitati da trasformazione squamose e molto tempo a maturità29. Inoltre, riferito di cortocircuito misure di corrente in HNEs sono più piccole di quelle in HBEs, suggerendo una finestra più piccola per rilevare l’efficacia terapeutica25.
Data la necessità di un modello di coltura del tessuto personalizzato, non invadente, respiratorio della funzione CFTR, abbiamo cercato di unire la sensibilità di un dosaggio di organoid gonfiore-base, con la natura non invasiva e respiratoria di HNEs. Qui, descriviamo il nostro metodo di generazione di culture 3-dimensionale “sferoide” di HNEs per lo studio individualizzato di CFTR in un’ analisi basata a gonfiore30. Sferoidi HNE polarizzano attendibilmente con l’apice epiteliale verso il centro della sfera, o lumen. Questo modello ricapitola le caratteristiche numerose di un epitelio respiratorio inferiore e fa maturare più velocemente di culture di ALI. Come un’analisi funzionale, sferoidi HNE quantificano in modo affidabile una funzione gamma di CFTR, come pure la modulazione in gruppi ben studiata mutazione (ad es., CFTR F508del). Questo test basati su gonfiore capitalizza le proprietà di trasporto di ioni/sale di CFTR, indirettamente di misurazione fluido afflusso nella sferoide come acqua segue efflusso sale apicale. In questo modo, stimolati sferoidi con CFTR completamente funzionale si gonfiano robustamente, mentre quelli con CFTR disfunzionale si gonfiano meno o ridursi. Questo viene quantificato attraverso analisi d’immagine di pre- e sferoidi di post-stimolazione 1h, misurazione area luminal e determinare la percentuale di cambiamento. Questa misura può essere confrontata attraverso gruppi sperimentali a schermo per bioattività di droga in modo specifico per ogni paziente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive la generazione di colture di sferoide paziente-derivato nasale cellulari in grado di produrre un modello individualizzato, specifico della funzione CFTR. Ci sono diversi passaggi chiave nel processo che dovrebbe essere frequentato molto attentamente per evitare difficoltà. In primo luogo è un’acquisizione di buon campione dal naso del paziente. Dovrebbe avere un buon campione > 50.000 cellule, limitato muco/detriti ed essere pronti per l’elaborazione all’interno di 4 h (anche se il successo ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, grant numero CLANCY14XX0 e attraverso la Fondazione fibrosi cistica, concedere il numero CLANCY15R0. Gli autori desiderano ringraziare Kristina Ray per la sua assistenza nel reclutamento dei pazienti e la vigilanza regolamentare. Gli autori desiderano anche ringraziare il gruppo di lavoro di HNE, sostenuto dalla Fondazione fibrosi cistica, che ha assistito nella generazione di funzionalità di HNE cultura: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Marty Solomon e Katherine Tuggle.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
| 15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
| 1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
| 35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
| 50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
| Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
| Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
| Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
| Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
| IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
| Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
| Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
| Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
| Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
| Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |
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