Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı
Summary
Desthiobiotin bir adenin-zengini eleman (vardır) motifi içeren bir sentetik 25-nükleotit RNA oligo, etiketleme sitozolik vardır-bağlayıcı proteinin belirli bağlantı verir.
Abstract
Vitro RNA-açılan özel RNA yapıları ve motifleri tanımak RNA bağlanıcı proteinler belirlenmesi amaçlı iletişim kurallarının ilk adımda hala büyük ölçüde kullanılır. Bu RNA-açılan iletişim kuralında, biotin, desthiobiotin, 3′ terminus streptavidin için geri döndürülebilir olarak bağlar ve böylece daha fazla altında proteinlerin elüsyon sağlayan RNA iplikçiğinin, değiştirilmiş bir formu ile ticari olarak sentezlenmiş RNA probları etiketlenir fizyolojik koşullar. RNA-desthiobiotin ile özellikle faiz RNA ile etkileşim proteinler aşağı çekmek için kullanılan manyetik boncuklar streptavidin etkileşimi aracılığıyla immobilize. Mesothelioma hücreleri sitozolik kısmını gelen sigara denatüre ve aktif proteinler, protein kaynağı olarak kullanılır. Burada anlatılan yöntem bilinen RNA proteinler ve bir faiz dizisini içeren 25-nükleotit (nt) uzun RNA prob arasındaki etkileşimi algılamaya uygulanır. Bu sabitleme veya öğeleri RNA molekülleri bir muhabir vektör tahlil kullanılarak elde mevcut istikrarsızlaştırıcı fonksiyonel karakterizasyonu tamamlamak yararlıdır.
Introduction
Gen ekspresyonu ve gen ürünü son seviyesi sıkıca mRNA kararlılığı ve mRNA çeviri hızı1etkileyen tarafından düzenlenmiş. Çoğu yasal mekanizmaların kodlamayan RNA ve/veya RNA bağlanıcı proteinler (RBPs) etkileşimleri ile hedeflenen mRNA aracılığıyla sarf. Bu genellikle 3′ Çevrilmeyen mRNA (3′ UTR – genom2kodlamayan bölümüne ait) belirli CISiçeren bölgedir- transtarafından tanınan düzenleyici elemanlarının (CRE),-miRNA ya da RBPs gibi faktörler rol 3. en çok çalışılmış CIS-içinde 3′ UTR, öğedir belirli AU bağlanıcı proteinler (AUBP) tarafından ve sırayla tanınır, adenin-zengini eleman (vardır) motifi neden olmaktadır ya mRNA bozulması/deadenylation (ARE-aracılı decay) veya mRNA sabitleme4.
Boyutu olduğunu 3′ UTR’nin calretinin, mRNA (CALB2) 573 bp uzun ve AREsite2, bir bioinformatic araç5tarafından tahmin ettiği gibi sözde AUUUA pentamer içerir. Bir sözde olan motif varlığı ile tutarlı, pmirGLO vektör-muhabir tahlil bir istikrar rol CALB2 mRNA6içinde bu öğesinin gösterdi. Son olarak, vitro RNA-açılan calretinin stabilize AUBP tanımlamak için kullanılan olan motif aracılığıyla mRNA.
Tüm kodlamayan RNA’ların proteinler7ile etkileşim, vitro RNA-açılan bir iyi yolu ve RNA-interactors tanımlamak için seçim ilk tahlil moleküler mekanizmaları çözmekte yardımcı olmak için çünkü. Bu RNA-açılan yönteminde biotin (desthiobiotin) 3′ terminus RNA iplikçiğinin, değiştirilmiş bir formla etiketli, ticari olarak sentezlenmiş RNA probları kullanılmıştır. RNA-desthiobiotin ile özellikle ilgi bağlı-RNA ile etkileşim proteinler aşağı çekmek için kullanılan manyetik boncuklar streptavidin etkileşimi aracılığıyla immobilize. Mesothelioma hücreleri sitozolik kısmını gelen sigara denatüre ve aktif proteinler, protein kaynağı olarak kullanılır. Böyle RNA bağlı proteinler manyetik boncuklar, % 12’si SDS-sayfa jel çalıştırmak, bir membran transfer ve farklı antikorlar ile probed üzerinden eluted.
Standart streptavidin-biotin benzeşme arıtma yordam, sert denatürasyon koşulları ilişkili proteinler8, elute için güçlü geri dönüşü olmayan biotin streptavidin bağ bozmak için gerekli olan ayrılma neden olabilir protein kompleksleri. Biotin, aksine desthiobiotin ters streptavidin için bağlar ve rekabetçi biotin için protein elüsyon nazik bırakılınca koşar ve doğal olarak biotinylated molekülleri9yalıtım kaçınarak, tamponlu bir çözüm ile yerlerinden olduğunu, Teknik yerli protein kompleksleri yerel koşullar altında yalıtmak için ideal olduğunu düşündüren.
Tuz konsantrasyonu, azalan bakiyeli ajanlar ve deterjan yüzde tarafından belirlenir, vitro bağlayıcı koşulları ve sıkılık, yakın bu hücresel bağlamda mevcut gerçek vivo içinde etkileşimleri tanımlamak için olması gerekir. Burada uygulanan bağlama koşulları daha önce bir AU-bağlayıcı protein10Hur kimliği için uygun olarak gösterilmiştir. Uygun ciltleme koşullardan en iyi duruma getirme zaman alıcı ve zor olabilir bu yana bu yaklaşım zaman kazanmak. Buna ek olarak, bu yöntem bir başlangıç iletişim kuralı olarak herhangi bir RNA-açılan deneme için kullanılan ve yavaş yavaş tuzları ve deterjanlar konsantrasyon değiştirme gliserol yüzdesini değiştirerek ve diğer tuzları ekleyerek optimize edilebilir. Ayrıca, biz bile bir kısa 25-nükleotit RNA-bir pentamer yataklık sonda vardır-motif belirli bir AUBP ile etkileşim göstermek için kullanılabileceğini gösterdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kodlamayan genom3‘ e 3’ UTRs ait ve onların işlev7uygulamak için tüm kodlamayan RNA’ların proteinler ile etkileşim kurabilir. Ne zaman memeli genom pervasively transkripsiyonu için kurmak ve uzun kodlamayan RNA’ların16önemli bir kısmını üretilen, delillerin ortaya çıkan bu uzun kodlamayan RNA’ların ile etkileşimde bulunan gen ifadesinin düzenlenmesine çalışması gösterdi kompleksleri17Kromatin remodeling….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Sinergia grant CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung ve Zürih Krebsliga tarafından desteklenmiştir.
Materials
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti – HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | – | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit – 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – α – tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS – goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti – Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI – 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS – Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin – streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 – aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | – | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | – | the synthesis scale – 0.04 µmol – HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 – 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
References
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3′ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
- von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
- Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
- Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- . Magnetic bead technology for better assay development Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013)
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5′ untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
- Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
