Culture organotypique en trois dimensions des organes sensoriels vestibulaires et auditives

Summary

Cultures organotypique tridimensionnelle de l’utricule murin et la cochlée en défricher collagène j’ai gélifie morphologie tissulaire innée preserve optiquement, permettant une stimulation mécanique au moyen d’ajustement de la rigidité de la matrice et permettent la livraison de gène induite par le virus.

Abstract

Les organes sensoriels de l’oreille interne sont difficiles à étudier chez les mammifères en raison de leur inaccessibilité aux manipulations expérimentales et d’observation optique. En outre, bien que des techniques de culture existants permettent des perturbations biochimiques, ces méthodes ne fournissent pas un moyen d’étudier les effets de la force mécanique et la rigidité des tissus pendant le développement de l’oreille interne des organes sensoriels. Nous décrivons ici une méthode pour la culture organotypique tridimensionnelle de l’utricule murine intact et cochlée qui permet de surmonter ces limitations. La technique pour l’ajustement d’une rigidité de la matrice tridimensionnelle décrite ici permet la manipulation de la force élastique s’opposant à la croissance des tissus. Cette méthode peut donc être utilisée pour étudier le rôle des forces mécaniques au cours du développement de l’oreille interne. En outre, les cultures permettent la livraison de gène induite par le virus, qui peut être utilisée pour des expériences de gain - et perte de fonction. Cette méthode de culture préserve innée des cellules ciliées et des cellules et sert comme une alternative potentiellement supérieure à la culture traditionnelle à deux dimensions des organes sensoriels vestibulaires et auditives.

Introduction

L’étude de la plupart des aspects du développement des organes de mammifères a été facilitée par les systèmes in vitro . Deux méthodes principales sont maintenant utilisées pour la culture des organes sensoriels vestibulaires : flottant¹ et adhérentes² préparations. Les deux méthodes permettent l’étude des cellules ciliées vulnérabilités³ et régénération^1,4 in vitro. En outre, le rôle du développement de l’encoche^5,6, Wnt^7,

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par les comités de l’Université Rockefeller d’utilisation et animalier et de l’University of Southern California.

1. (facultative) préparation du collagène I Solution de Tendons de Mouse-tail

Remarque : Collagène I solutions sont disponibles dans le commerce. Suivez les instructions du fabricant pour la préparation du gel.

1. Euthanasier des souris jeunes adultes (âgés de 3 à 5 semaines) 5-10 de toute souche de type sauvage avec le dioxyde de carbone conformément au protocole approuvé par les institutionnels animalier et Comité d’utilisati....

Results

Organes sensoriels vestibulaires et auditives d’oreilles embryonnaires, cultivées en collagène 40-Pa j’ai gels imitant faible rigidité des conditions embryonnaires¹¹, conserver les structures tridimensionnelles relativement normales (Figure 1) et l’entretien des cellules ciliées et soutenir des cellules (Figure 2 et Figure 3). Bien que soutenant la densité cellulaire diminue d.......

Discussion

Les signaux moléculaires qui médiat de la croissance et la différenciation dans l’oreille interne au cours du développement ont été étudiés intensivement^5,6,7,8,9,10. Toutefois, les données obtenues dans le système utriculaire modèle suggèrent que signaux mécaniques, sentis à travers les jonctions cellulaires et l’activation .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#10 Lames chirurgicales	Miltex	4-110
#5 Pince	Dumont	11252-20
Boîte de Pétri 100 mm	Sigma	P5856-500EA
250 uL pointes de pipette à grand orifice	USA Scientific	1011-8406
Boîte de Pétri à fond de verre de 30 mm	Matsunami Glass USA Corporation	D35-14-1.5-U
4 puits plaque	Thermo Fisher Scientific	176740
4-Hydroxytamoxifène  ;	Sigma	H7904
60  ; mm Boîte de Pétri	Thermo Fisher Scientific	123TS1
Acide acétique  ;	Sigma	537020
Ad-GFP	Vecteur Biolabs	1060
Anti-GFP, fraction IgY de poulet	Invitrogen	A10262  ;
Anti-Myo7A	Proteus Biosciences	25-6790
Anticorps anti-Sox2 (Y-17)	Santa Cruz	sc-17320
Dosage de l’acide bicchoninique	Thermo Fisher Scientific	23225
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit d’imagerie	Thermo Fisher Scientific	C10340
Collagenase I	Gibco	17100017
D-glucose	Sigma	G8270
DMEM/F12  ;	Gibco	11320033
Facteur de croissance épidermique	Sigma	E9644
Sérum fœtal bovin (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16140063
Facteur de croissance des fibroblastes	Sigma	F5392
Extracteur de micropipette flamant/brun	Sutter Instrument	P-97
Glutamine	Sigma	G8540
HBSS	Gibco	14025092
hémocytomètre  ;	Daigger	EF16034F
HEPES	Sigma	H4034
Insuline	Sigma	I3536
Ciseaux d’iridectomie  ;	Zepf Medical Instruments	08-1201-10  ;   ;
Micro-injecteur	Narishige	IM-6
Nicotinamide	Sigma	N0636
PBS (10X), pH 7,4	Gibco	70011044
PBS (1X), pH 7,4	Gibco	10010023
Indicateur de pH rouge de phénol	Sigma	P4633° ;
Éthanol pur, 200 Proof	Decon Labs  ;	2716
RFP anticorps	ChromoTek	; 5F8
Bicarbonate de sodium	Sigma	S5761
Hydroxyde de sodium	Sigma	S8045
Sélénite de sodium	Sigma	S5261
Vortex de table  ;	VWR	97043-562
Transferrin	Sigma	T8158
Trypan bleu  ;	Sigma	T6146