伝達物質の放出を勉強する後根神経節細胞の分離と培養
Summary
後根神経節 (DRG) の初代培養は、生理機能や感覚ニューロンの病理に関連するイベントを研究するよく使用されます。ここでは、我々 は FF 神経ペプチド受容体選択的なアゴニスト 2 刺激を入力後、神経伝達物質の放出を検出するための腰部後根神経節文化の使用を示します。
Abstract
後根神経節 (DRG) では、感覚ニューロンの細胞体が含まれています。ニューロンのこのタイプは、皮膚、筋肉、内臓、中枢神経系の脊髄後角などの末梢組織を支配する 2 つの軸索と、擬似単極です。感覚ニューロンは、体性感覚、タッチ、痛み、熱、および自己感応の感覚を送信します。したがって、DRG 初代培養は、侵害受容の分子機構、感覚ニューロンと神経系の発達の生理機能を研究に活躍しています。培養神経細胞は、電気生理学、シグナル伝達、神経伝達物質のリリース、またはカルシウム イメージングを含む研究で適用できます。DRG 初代培養、科学者が単一の生化学の変化を監視する解離の DRG ニューロンの文化や生体内で実験に関連付けられている複数のセルは、多くの制約を克服します。市販に比べて利用 DRG ハイブリドーマ細胞不死化後根神経節神経細胞、組成や一次電池の特性より組織の感覚ニューロンに似ています。ただし、1 つの動物から分離できる培養後根神経節細胞の数が限られたため薬物標的の探索のハイスループット画面を実行することは困難です。現在の記事では、DRG のコレクションおよび文化のための手順を示します。さらに、FF の神経ペプチド受容体 2 型のアゴニストと後根神経節細胞 (カルシトニン遺伝子関連ペプチド (CRGP) と P 物質 (SP)) ペプチド神経伝達物質の放出を誘発する (NPFFR2) の治療を紹介します。
Introduction
感覚ニューロンの細胞体は後根神経節内に含まれます。これらのニューロンは擬似単極、末梢組織と中枢神経系を支配します。感覚ニューロンの末梢神経終末は、筋肉、皮膚、内臓器官や骨、他の組織.の間であります。体性感覚1,の2つの昇順経路を介して脳に転送される脊髄後角、および信号の終末神経の末梢の感覚信号します。体性感覚を可能に (すなわちタッチ、痛み、および熱感覚) を感じ、知覚運動と空間的な向き (固有受容感覚)1,の3体。4 がある骨格筋、皮膚の受容に応答グループ II (a β) 繊維の感覚に対応し、グループ III (Aδ) (核内局在) 繊維と痛みに応答グループ V (C) 繊維を含むプライマリの求心性軸索のサブクラス群と温度。C 線維のみ、残りが異なる度に有髄髄、おりません。
侵害受容器は、組織の損傷の可能性を運ぶ侵害刺激 (機械的、熱的、化学的刺激) によって活性化される第一次感覚ニューロンです。これらのニューロンは、Aδ 有髄線維と無髄の C 線維1,4で構成されます。Aδ 繊維エクスプレスの SP、CGRP、神経成長因子 (NGF 受容体 trkA) 受容体C 線維は、ペプチドおよび非ペプチド作動性の C 線維に分類されます。その一方で、非ペプチド作動性 C 線維はグリア由来神経栄養因子 (GDNF、RET、GFR 受容体)、isolectin、IB4 と ATP 依存性イオン チャネルのサブタイプ (P2X3)5,6、7のための受容器を表現します。侵害受容器のイオン チャネルの発現によって区別、神経栄養因子による活性化サイトカイン、神経ペプチド、ATP、または他の化学化合物8することができます。刺激、CGRP、SP、グルタミン酸などの神経伝達物質は、侵害受容性信号2を送信する脊髄後角における感覚ニューロンの端末からリリースされるかもしれない。DRG はだけニューロンから成るとはありませんが、また衛星グリア細胞を含みます。衛星細胞感覚ニューロンを囲む、機械的および代謝サポート9,10。興味深いことに、痛み感覚11の調節に DRG 衛星グリア細胞が侵されることを示す証拠の成長するボディがあります。
感覚ニューロンは最も頻繁に第一次神経細胞12を使用、電気生理学、シグナル伝達、神経伝達物質放出の研究に利用されているが報告されています。神経の開発、炎症性疼痛、神経因性疼痛、(かゆみ) のような皮膚感覚軸索伸長12,13,14,15の細胞メカニズムを探るにもよく使用されます。DRG 初代培養は、実験科目では実行できない研究を実行する単一または複数のセルの生化学的変化を評価するために解離ニューロンとして培養することができます。最近、後根神経節が大きくトランスレーショナルリサーチ16に恩恵を受ける可能性があります人間の臓器提供者から養殖に成功しました。その一方で、後根神経節外植片として感覚ニューロンは培養も。DRG 植ニューロン、シュワン細胞と衛星グリア細胞を含む元の組織構造を維持、神経および非神経細胞17間の相互作用の研究に特に有用です。DRG 初代培養は、2.5 h の内で簡単に用意できます。細胞の組成と性質は後根神経節、ソースの反射率の高い、実験の要求に応じて特定後根神経節 (腰部や胸部の DRG) を収集できるよう。胎児・新生児の DRG ニューロンの文化必要軸索伸長を誘発して生き残るために NGF が大人ニューロンの文化メディア12,17に神経栄養因子の添加を必要としません。ND7/23 と F11、実験動物の使用を必要としないなどの市販の DRG ハイブリドーマ細胞株もあります。ただし、一時的な受容器の潜在的な陽イオンの欠如チャネル亜科 V メンバー 1 (TRPV1) 式 (小さな侵害受容ニューロンの重要なマーカー) と不適合遺伝子発現プロファイルの制限、アプリケーション18。最近では、行は、ラット (50B11)19から派生されている不死の後根神経節神経細胞およびマウス (MED17.11)20に適しているはターゲティング研究の高スループット画面で使用します。しかし、これらの細胞株の遺伝子発現はまだ実行します。したがって、感覚ニューロンへこれらの不死化細胞の比較検証実験はまだ進行中です。
NPFFR2 は、後根神経節で合成、脊髄後角21の感覚神経終末に移行します。この記事で私たちは腰部後根神経節細胞を培養し、CGRP と SP の神経伝達物質の放出を誘発する NPFFR2 のアゴニストとそれらを扱うのためのプロトコルを提供します。NPFFR2 への依存は、NPFFR2 小さい干渉 RNA (siRNA) 培養後根神経節細胞にトランスフェクション可能性がありますを使用してさらにテストされます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿ではラット腰椎のコレクション、酵素分解、文化紹介 DRG。NGF 神経栄養サポート、DRG ニューロンの軸索は細胞播種後 3 日以内延長。拡張の軸索細胞で細胞細胞体で合成され、軸索線維に沿って運ばれる CGRP タンパク質染色後明確に観測される.日以内のニューロンを囲むこれらの分割のグリア細胞をできるように、拡張も衛星細胞のプロセス。このプロトコルにより成長したプライマリの…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
英語の編集を博士 M. コーキンズを感謝いたします。この作品は、長庚記念病院 (CMRPD1F0482)、長庚大学、健康加齢研究センター (EMRPD1G0171) と省の科学と技術 (105-2320-B-182-012-MY2) によって支持されました。
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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