Iniezioni di Lipopolysaccharide in topi per simulare l'ingresso di prodotti microbici derivati dopo la violazione della barriera intestinale
Summary
Qui è presentato un protocollo per simulare l’ingresso di composti derivati batterici dopo la violazione della barriera intestinale. Una bassa dose subletale di lipopolisaccaride è stata iniettata sistemica in topi, che sono stati monitorati per 24 h post-iniezione. L’espressione delle citochine pro-infiammatorie è stata determinata a parecchi punti di tempo nella milza, nel fegato e del colon.
Abstract
La barriera epiteliale intestinale separa l’host dal microbiota che è normalmente tollerato o ignorato. La violazione di questo ostacolo provoca l’ingresso di batteri o di prodotti derivati da batteri nell’ospite, l’accesso alla circolazione di host e gli organi interni che conducono all’infiammazione incontrollata come osservato nei pazienti con malattia infiammatoria intestinale (IBD), che sono caratterizzati da una maggiore permeabilità epiteliale intestinale.
Per simulare l’ingresso di composti derivati batterici nell’ospite, un modello di endotoxemia è stato adottato in quali lipopolisaccaride (LPS), un componente della parete cellulare esterna dei batteri gram-negativi, sono state iniettate in topi. In questo studio, una dose subletale di LPS è stata iniettata intraperitonealmente ed i topi sono stati successivamente controllati per 8 h, utilizzando un punteggio di malattia. Inoltre, l’espressione i livelli delle citochine infiammatorie Il6, Il1b e Tnfa sono stati analizzati nella milza, fegato e colon di qPCR in diversi momenti dopo l’iniezione di LPS. Questo modello potrebbe essere utile per gli studi che coinvolgono la ricerca della risposta immunitaria dopo l’invasione di microrganismi o di prodotti derivati dal batterico causati da una violazione di barriera delle superfici del corpo.
Introduction
L’intestino umano è colonizzato con un grande consorzio di microrganismi che forma il microbiota, che ha sviluppato un rapporto di reciproco beneficio con l’host durante l’evoluzione. In questo rapporto, l’host fornisce una nicchia sicura per il microbiota, considerando che il microbiota fornisce vitamine, digestione dei nutrienti e protezione dagli agenti patogeni per l’host, dove il microbiota si trova1. Quando questo rapporto vantaggioso tra l’host e il microbiota è disturbato, possono sviluppare malattie, come la malattia infiammatoria intestinale (IBD). IBD è una malattia infiammatoria cronica multifattoriale dell’intestino causata da fattori genetici e ambientali che si presentano in due forme principali, (CD) la malattia di Crohn e colite ulcerosa (UC). Nonostante le similitudini tra le due forme IBD, sono caratterizzati da alcune differenze nella posizione e nella natura delle modificazioni infiammatorie. CD è un disordine infiammatorio di ricaduta transmurale che potenzialmente possa estendere a qualsiasi parte del tratto gastrointestinale, mentre UC è non transmurale ed è limitato ai due punti. Inoltre, mutazioni in proteine Nucleotide-binding dominio contenenti oligomerizzazione 2 (NOD2), un recettore di riconoscimento di pattern (PRR) che riconosce muramil dipeptide (MDP), un componente della parete cellulare dei batteri Gram-positivi più e – negativi, è associata al CD2. Inoltre, Escherichia coli (Escherichia coli), Listeria e streptococchi e i loro prodotti sono stati tutti trovati all’interno dei macrofagi nei pazienti del CD che sono entrati nell’host dopo una barriera violazione3. Quando i batteri o loro prodotti immettono l’host durante lo sviluppo del CD, il sistema immunitario sviluppa una risposta che porta alla produzione di anticorpi anti-batterica4di circolazione. Forse, la prova più convincente per il ruolo del microbiota nella patogenesi delle IBD deriva da modelli murini. Quando gli animali sono trattati con antibiotici, o topi siano tenuti in germe-free (GF), la gravità della malattia è ridotta nella maggior parte dei modelli di colite, come in IL-10-/-topi che non sviluppano colite in GF strutture5,6. Inoltre, colite disturba anche la composizione del microbiota, che è caratterizzata da una composizione squilibrata e ridotto ricchezza chiamato disbiosi7. La conseguenza di IBD può essere un aumento della permeabilità intestinale che può portare all’ingresso di microbi e di prodotti derivati dal microbica nell’ospite.
Negli animali, l’applicazione di Destrano solfato di sodio (DSS) induce una violazione epiteliale intestinale che conduce a un aumento della permeabilità della barriera epiteliale8. Portale LPS le concentrazioni sono elevate in animali con DSS colite9. Interessante, gli animali carenti C tipo lectina recettore adesione intracellulare specifica molecola-3 afferrando nonintegrin 1 omologo-correlate (segno-R1) sono protetti da colite DSS e LPS indotta endotossiemia10. Per diffondere ulteriormente nell’ospite, batteri o batteri derivati prodotti devono superare la barriera vascolare11, cavità peritoneale, in cui si trova il piccolo e grande intestino, linfonodi mesenterici e/o il fegato12. Per ridurre la complessità di questo sistema, è stato usato un composto derivato batterico definito. LPS, che provoca endotossiemia dopo intraperitoneale (i.p.) o endovenosa (i.v.) iniezione13 è stato iniettato in topi, per studiare l’espressione delle interleuchine Il6 e Ilb e la citochina Tnfa in risposta ai LPS.
LPS è un pattern molecolare associati (PAMP) espresso come un componente della parete cellulare dei batteri gram-negativi, che consiste del lipide A (i PAMP principale nella struttura di LPS), un oligosaccaride di core e un O lato catena14. Recettore Toll-like 4 (TLR4) espresse da cellule dendritiche, macrofagi e cellule epiteliali riconosce LPS15, che richiede Co-recettori per associazione appropriata. La fase acuta LPS-proteina (LBP) si lega LPS per formare un complesso che trasferisce LPS al cluster di differenziazione 14 (CD14), una proteina di membrana ancorate glicosilfosfatidilinositolo. CD14 ulteriormente navette LPS per l’antigene del linfocita 96 o anche conosciuto come MD-2, che è associato con il dominio extracellulare di TLR4. L’associazione del LPS a MD-2 facilita la dimerizzazione di TLR4/MD-2 per indurre cambiamenti conformazionali di reclutare molecole intracellulari adattatore per attivare l’a valle segnalazione sentiero14, che comprende il primario di differenziazione mieloide gene di risposta 88 (MyD88) – via del dipendente e il TIR dominio contenenti adattatore-induzione dell’interferone-β (TRIF) – via dipendente16. Il riconoscimento dei LPS di TLR4 quindi attiva il pathway di NF-κB e induce l’espressione di citochine proinfiammatorie, come TNFα, IL-6 e IL-1 β17.
In particolare, quando LPS è iniettato in animali, la concentrazione di LPS dato agli animali, il background genetico dell’animale e la dieta deve essere considerato. Alte concentrazioni di LPS conduce ad uno shock settico, caratterizzato da ipotensione e guasti multipli dell’organo e infine a morte18. I topi sono meno sensibili ai LPS rispetto agli esseri umani, dove le concentrazioni di LPS tra 2-4 ng/kg di peso corporeo (BW) sono in grado di indurre una tempesta di citochina19. Per topi, la dose letale (LD50), che induce la morte in metà dei campi di topi da 10-25 mg/kg BW20 a seconda del ceppo del mouse utilizzato. Per i ceppi comunemente usati del mouse, C57Bl/6 e BALB/c, la dose letale 50% (LD50) è di 10 mg/kg di peso corporeo. Al contrario, i ceppi C3H/HeJ e C57BL/10ScCr sono protetti da LPS indotto endotossiemia, che è dovuta a mutazioni di Tlr421. Di conseguenza, topi carenti di Tlr4 sono iporeattivo per iniezioni con LPS22. Altre linee di topi geneticamente modificati per, ad esempio topi PARP1-/-23 sono resistenti a scossa tossica indotta da LPS.
Il modello del mouse descritto qui utilizza una dose subletale di LPS somministrato per via sistemica per simulare le conseguenze della diffusione di LPS dopo la violazione della barriera delle superfici del corpo. La concentrazione di LPS selezionata (2 mg/kg BW) non ha indotto mortalità in topi C56Bl/6, ma il rilascio indotto delle citochine pro-infiammatorie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo imita i processi immunologici che si verificano dopo l’invasione di prodotti microbici derivati. Fasi critiche all’interno del protocollo sono la selezione della riga del mouse, lo stato di igiene dei topi, la dose di LPS, il monitoraggio degli animali per l’avvenimento di endotossiemia e il punto di tempo dell’esperimento terminazione. La cosa più importante, il background genetico del ceppo del mouse deve essere considerato. Del mouse differenti ceppi hanno diversa suscettibilità ai LPS. Ad esempio,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN è supportata dalla Fondazione nazionale svizzero (FNS 310030_146290).
Materials
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | K1081 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, | Applied Biosystems, Foster City, CA, USA | 4368813 | |
| RNase-Free DNase Set, | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| LPS Escherichia coli O111:B4 | Invivogen, San Diego, CA, USA. | tlrl-eblps | |
| Omnican 50 Single-use insulin syringe | B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany | 9151125 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologie, Santa Clara, USA | not applicable | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf, Hamburg, Germany | not applicable | |
| Centrifuge Mikro 220R | Hettich, Kirchlengern, Germany | not applicable | |
| Dissection tools | Aesculap, Tuttlingen, Germany | not applicable | |
| Fast-Prep-24 5G Sample Preparation System | M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA | not applicable | |
| NanoDrop ND-1000 | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | not applicable | |
| TRI Reagent | Zymo Research, Irvine, CA, USA | R2050-1 |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Abreu, M. T., et al. Mutations in NOD2 are associated with fibrostenosing disease in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology. 123, 679-688 (2002).
- Liu, Y., et al. Immunocytochemical evidence of Listeria, Escherichia coli, and Streptococcus antigens in Crohn’s disease. Gastroenterology. 108, 1396-1404 (1995).
- Schaffer, T., et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae mannan antibodies (ASCA) of Crohn’s patients crossreact with mannan from other yeast strains, and murine ASCA IgM can be experimentally induced with Candida albicans. Inflamm Bowel Dis. 13, 1339-1346 (2007).
- Sellon, R. K., et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in interleukin-10-deficient mice. Infect Immun. 66, 5224-5231 (1998).
- Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., Eliopoulos, A. G. The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 4, 28 (2014).
- Schaubeck, M., et al. Dysbiotic gut microbiota causes transmissible Crohn’s disease-like ileitis independent of failure in antimicrobial defence. Gut. 65, 225-237 (2016).
- Steinert, A., et al. The Stimulation of Macrophages with TLR Ligands Supports Increased IL-19 Expression in Inflammatory Bowel Disease Patients and in Colitis Models. J Immunol. 199, 2570-2584 (2017).
- Gabele, E., et al. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH. J Hepatol. 55, 1391-1399 (2011).
- Saunders, S. P., et al. C-type lectin SIGN-R1 has a role in experimental colitis and responsiveness to lipopolysaccharide. J Immunol. 184, 2627-2637 (2010).
- Spadoni, I., et al. A gut-vascular barrier controls the systemic dissemination of bacteria. Science. 350, 830-834 (2015).
- Balmer, M. L., et al. The liver may act as a firewall mediating mutualism between the host and its gut commensal microbiota. Sci Transl Med. 6, 237ra266 (2014).
- Maier, R. V., Mathison, J. C., Ulevitch, R. J. Interactions of bacterial lipopolysaccharides with tissue macrophages and plasma lipoproteins. Prog Clin Biol Res. 62, 133-155 (1981).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Deng, M., et al. Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol. 190, 5152-5160 (2013).
- Kagan, J. C., et al. TRAM couples endocytosis of Toll-like receptor 4 to the induction of interferon-beta. Nat Immunol. 9, 361-368 (2008).
- Akira, S., Uematsu, S., Takeuchi, O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801 (2006).
- Cohen, J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 420, 885-891 (2002).
- Suffredini, A. F., et al. Effects of recombinant dimeric TNF receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration. J Immunol. 155, 5038-5045 (1995).
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5, 143-153 (2014).
- Poltorak, A., et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282, 2085-2088 (1998).
- Hoshino, K., et al. Cutting edge: Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 162, 3749-3752 (1999).
- Corral, J., et al. Role of lipopolysaccharide and cecal ligation and puncture on blood coagulation and inflammation in sensitive and resistant mice models. Am J Pathol. 166, 1089-1098 (2005).
- Shrum, B., et al. A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model. BMC Res Notes. 7, 233 (2014).
- Brandwein, S. L., et al. Spontaneously colitic C3H/HeJBir mice demonstrate selective antibody reactivity to antigens of the enteric bacterial flora. J Immunol. 159, 44-52 (1997).
- Macpherson, A. J., McCoy, K. D. Standardised animal models of host microbial mutualism. Mucosal Immunol. 8, 476-486 (2015).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of Mice, Dirty Mice, and Men: Using Mice To Understand Human Immunology. J Immunol. 199, 383-388 (2017).
- Wirtz, S., et al. Protection from lethal septic peritonitis by neutralizing the biological function of interleukin 27. J Exp Med. 203, 1875-1881 (2006).
