Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

Summary

Hier präsentieren wir eine organotypischen Kultivierung Protokoll zur embryonalen Organe wachsen in-vitro-. Mit dieser Methode kann die Entwicklung der embryonalen Gewebe untersucht werden und gleichzeitig ein hohes Maß an Kontrolle über die Kultur Umwelt.

Abstract

Das embryonale Huhn wird häufig als zuverlässige Modellorganismus für vertebrate Entwicklung verwendet. Seine Erreichbarkeit und kurze Inkubationszeit macht Zeit es ideal für Experimente. Derzeit ist die Studie dieser Entwicklungsstörungen Wege im Huhn Embryo mittels Inhibitoren und Drogen an lokalisierten Standorten und bei niedrigen Konzentrationen mit einer Vielzahl von Methoden. In-vitro- Gewebekulturen ist eine Technik, die es die Untersuchung von Gewebe getrennt vom Wirtsorganismus ermöglicht, während gleichzeitig viele der körperlichen Einschränkungen vorhanden, bei der Arbeit mit ganzen Embryonen, wie die Anfälligkeit der Embryonen zu umgehen hohe Dosen von potenziell tödlichen Chemikalien. Hier präsentieren wir Ihnen eine organotypischen Kultivierung Protokoll für die Kultivierung der embryonalen halben Kopf in Vitro, präsentiert neue Möglichkeiten für die Prüfung von Entwicklungsprozessen über den derzeit etablierten Verfahren.

Introduction

Das embryonale Huhn (Gallus Gallus) ist ein hervorragendes Modellorganismus häufig verwendet im Bereich der Biologie. Die Inkubationszeit beträgt etwa 21 Tage und viele Eier können inkubiert werden gleichzeitig, Experimente zu machen, schnell und effizient. Vielleicht ist vor allem der Embryo auch leicht manipuliert ermöglicht die umfassende Studie der wichtigsten Entwicklungsprozesse und der Gene und Proteine, die diese Prozesse steuern.

Das embryonale Huhn Auge ist ein komplexes Organ, das durch das Zusammenspiel einer Reihe von verschiedenen Geweben ähnlich wie viele andere Körpersysteme entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung dieser Gewebe, besonders in fortgeschrittenen Stadien der Entwicklung. Z. B. möglicherweise die mehrschichtige Netzhaut von besonderem Interesse für alle, die die Entwicklung des Nervensystems. Alternative Methoden, die das Studium der anderen Augengewebe zu ermöglichen, wie z. B. die Hornhaut, Glaskörperblutung Körper, der Linse, der Sklera und die Augenlider für Forscher von Nutzen sind. Das Huhn embryonalen Auge enthält auch eine Reihe von flachen Knochen, der skleralen Gehörknöchelchen, die als Modell für die Untersuchung von intramembranous Knochen Induktion und Verknöcherung in Wirbeltieren¹verwendet werden können.

Derzeit gibt es eine Reihe von Methoden zur Untersuchung der embryonalen Entwicklung. Mikroinjektionen von inhibitorischen Antikörpern oder anderen hemmenden Moleküle^2,3, chirurgisch implantiert Microbeads Inhibitor⁴trieft und Elektroporation⁵ sind alle Methoden, die zum Downregulate Gene verwendet werden können oder in einem Embryo interessierender Proteine. Ähnliche Methoden sind an Upregulate Proteine verwendet. Diese Methoden sind nicht ohne ihre Grenzen. Beispielsweise wenn Sie Chemikalien verwenden, um die embryonale Entwicklung zu ändern, die tödlichen Auswirkungen auf den Embryo ausgewertet werden müssen, und dies schränkt die Verwendung der oben genannten Methoden, um lokalisierte Websites Anwendung bei Dosen niedrig genug, um die Überlebensfähigkeit der gewährleisten die Embryo.

In-vitro- Gewebekulturen wurde in einer Vielzahl von Organismen verwendet, um Entwicklung zu studieren und kann verwendet werden, um einige der oben genannten Einschränkungen zu umgehen. Beispielsweise sind die Oberschenkelknochen⁶, Feder Knospen^7,8und Gliedmaßen⁹ des Huhns alle untersucht worden mit Gewebe züchten Methoden, wie die Hoden der Maus¹⁰ und die Wurzeln und stengel der Pflanzen¹¹. Diese Methoden Wissenschaftler gewähren ein hohes Maß an Kontrolle über die Gewebeentwicklung, wie z. B. die Fähigkeit, die Temperatur schwanken und verändern die nährstoffverfügbarkeit. Die Isolierung des Gewebes aus der gesamte Embryo macht es auch weit weniger anfällig gegen die tödlichen Auswirkungen von Chemikalien, wodurch es Manipulation Studien auf globaler Ebene bei höheren Konzentrationen. Ein weiterer bemerkenswerter Vorteil der in-vitro- Kultivierung ist der Erhalt der zellulären Umgebung das Gewebe; die Anordnung der Gewebe relativ unverändert bleibt, die es ermöglichen, die Interaktionen zwischen verschiedenen Gewebe Arten⁹zu untersuchen. In-vitro- Kultivierung öffnet Türen zu weiteren experimentellen nähert sich somit in in Vivo oder in Ovo Modelle nicht verfügbar.

Derzeit ist die Entwicklung des embryonalen Auges mit Chemikalien besonders anspruchsvoll. Eine Reihe von extraembryonic Membranen abdecken des Embryos erschwert Microbeads oder Chemikalien anzuwenden; der Embryo ist auch sehr aktiv in der Eizelle, als es älter, wird eine ohnehin schwierige Methode weiter zu erschweren. Dieses Protokoll ermöglicht einen einfachen Zugang für das Auge und seine umgebenden Gewebe, diese Hindernisse zu beseitigen, und gleichzeitig neue Möglichkeiten, die Entwicklungsprozesse im Auge zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde gegründet, um die Induktion der skleralen Gehörknöchelchen innerhalb der embryonalen Auges zu studieren.

Protocol

Hinweis: Für Embryo Bühnen, nutzen Sie die Hamburger und Hamilton12 (HH) Inszenierung Tabelle. (1) Embryo Inkubation Inkubieren Sie befruchteten Hühnereiern in einem sterilen, temperaturgeführte Inkubator bei 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit. Drehen Sie die Eier 1 X pro Tag und es ihnen ermöglichen, zu HH34 inkubieren (8 Tage nach Befruchtung). 2. Vorbereitung und Sterilisation von Materialien <ol…

Representative Results

Mit dieser Methode kann Auge embryonalen Huhn vom 8. Tag seiner Entwicklung (HH34) in Vitro für 4 Tage kultiviert werden. Vier Tage in Ovo Entwicklungsstand entspricht HH38. Diese Kultivierung Methode unterstützt die Entwicklung der Feder Knospen rund um das Auge und an den Augenlidern (Abbildung 1 b). Diese Feder Knospen sind nicht vorhanden in Ovo im HH34 vor der Kulti…

Discussion

Dieses Protokoll nutzt etablierten Gewebe züchten Techniken um ein Huhn Auge aus embryonalen Tag 8 (HH34) wachsen in Vitro für 4 Tage. Diese Raster-Kultivierung Methode wurde ursprünglich von Trowell¹⁵beschrieben. Wir optimieren ein Protokoll von Pinto und Halls 1991 Studie¹⁶ unter Verwendung einer halbdurchlässigen Membran mit dem Gitter, induktive Signalübertragung zwischen getrennten Gewebeschichten der embryonalen Auge¹⁵zu studieren…

Materials

35 mm cell culture petri dishes	Corning	353001	easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
100 mm cell culture petri dishes	Corning	353003	tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic
paper tissue	Kimtech	34155	Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton
wire mesh	n/a	n/a	stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)
disposable glass pipettes	VWR	14673-010	Borosilicate glass disposable 5 3/4"
nutrient medium	Gibco	12591-038	Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)
penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458	10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised
filter paper	Whatman	1454 090	semi-porous filter paper 90mm
fertilized chicken eggs	Dalhousie University Agricultural College	n/a	can be obtained from local farms
sodium chloride (NaCl)	EMD	SX0420-3	sodium chloride crystals, reagent grade
1 L glass bottle	VWR	89000-240	1 L pyrex autoclavable glass bottle
ethanol	Fisher Scientific	BP82011	70% molecular biology grade
tupperware containers	n/a	n/a	store-bought and sterilized with EtOH
disposable razor blades	VWR	55411-050	single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)
plastic spoons	n/a	n/a	store-bought and sterilized with EtOH
dust mask	3M	n/a	3M 8500 Comfort Mask
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	paraformaldehyde, reagent grade, crystalline
neutral-buffered formalin	Fisher Scientific	72210	10% neutral buffered formalin
phosphate buffered saline (PBS)	n/a	n/a	10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)
15 ml falcon tubes	VWR	21008-216	presterilized centrifuge tubes
forceps	FST	n/a	fine forceps
chick saline	n/a	n/a	0.85% NaCl
tinfoil	n/a	n/a	store-bought
paper towel	n/a	n/a	store-bought