Summary

Microscopie de lumière-feuille pour la visualisation en trois dimensions des cellules immunitaires humaines

Published: June 13, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les cellules immunitaires noyées dans une matrice tridimensionnelle (3D) collagène microscope à lumière-feuille. Ce protocole précise également comment suivre la migration cellulaire en 3D. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans la matrice 3D.

Abstract

In vivo, l’activation, la prolifération et la fonction des cellules immunitaires tous se produisent dans un environnement de tridimensionnel (3D), par exemple dans les ganglions lymphatiques ou des tissus. Jusqu’à date, la plupart des systèmes in vitro reposent sur une surface bidimensionnelle (2D), tels que plaques de culture cellulaire ou de lamelles. De façon optimale de reproduire les conditions physiologiques in vitro, nous utilisons une matrice de collagène 3D simple. Collagène est l’une des principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) et a été largement utilisé pour constituer des matrices 3D. Pour l’imagerie 3D, la technologie de microscopie de lumière-feuille récemment développés (également dénommée microscopie illumination seul plan) est décrit avec acquisition haute vitesse, grande profondeur, faible de blanchiment et photocytotoxicité. En outre, microscopie à lumière-feuille est particulièrement avantageuse pour la mesure à long terme. Nous décrivons ici un protocole optimisé comment configurer et gérer les cellules immunitaires humaines, par exemple primaire humains lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses naturelles (NK) dans la matrice de collagène 3D pour une utilisation avec la microscopie en lumière-feuille pour l’imagerie de cellules vivantes et échantillons fixes. La procédure d’acquisition d’images et analyse de la migration cellulaire sont présentés. Une attention particulière est donnée pour mettre en évidence les étapes critiques et des facteurs pour la préparation des échantillons et l’analyse des données. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans une matrice de collagène 3D et n’est pas limité aux cellules immunitaires.

Introduction

La plupart des connaissances sur la migration cellules vient de 2D expériences1,2,3, qui sont normalement effectués dans un verre ou une surface en plastique d’une culture/imagerie plat. Toutefois, un scénario physiologique exige, dans la plupart des cas, un micro-environnement 3D, dans laquelle la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle décisif. ECM non seulement fournit l’essentiel de la structure 3D afin de maintenir la morphologie cellulaire appropriée, mais offre également des signaux de survie ou des indications directionnelles pour un fonctionnement optimal de nombreuses cellules4,5 . Par conséquent, il faut un environnement 3D pour mieux identifier les fonctions cellulaires et le comportement dans un environnement reflétant mieux le contexte physiologique.

Dans le corps humain, la plupart des cellules en particulier les cellules immunitaires, exercent leurs fonctions selon un scénario 3D. Par exemple, les lymphocytes T activés patrouillent tissus recherchant des cellules cibles, cellules naïves T migrent dans les ganglions lymphatiques dans la recherche de leurs cellules présentatrices d’antigène apparentés au cours de laquelle le mode de migration et les machines sont adaptées aux correspondants extracellulaire environnement,3,6,7. Le gel de collagène 3D a été largement utilisé comme une cellule 3D bien établies et bien caractérisé la culture système8,9,10. Nos travaux antérieurs montre que les lymphocytes humains primaires sont très mobiles et migrent à une vitesse moyenne d’environ 4,8 µm/min dans une matrice à base de collagène de 0,25 %11. Réarrangement du cytosquelette joue un rôle clé dans la migration de cellules12. Accumulation de preuves montre que les lymphocytes ne s’appliquent pas seulement à un seul mode de migration mais peuvent passer d’un certain comportement de migration selon l’emplacement, cytokines, microenvironnement, gradient chimiotactique et des signaux extracellulaires qui tune le comportement migratoire dans différentes manières 3.

Pour analyser efficacement les fonctions des cellules immunitaires et comportement, par exemple, migration, formation de protrusion ou le transport vésiculaire, c’est un avantage pour être en mesure d’acquérir des images dans des quantités relativement importantes de 3D de manière rapide et fiable. Pour l’imagerie 3D, la technologie de microscopie de lumière-feuille récemment développés (également dénommée microscopie illumination seul plan) offre une solution satisfaisante13,14. Au cours de l’acquisition de l’imagerie, une mince feuille de lumière statique est générée pour éclairer l’échantillon. De cette façon, sur le plan focal, une grande surface peut être illuminée simultanément sans affecter les cellules hors plan. Cette fonctionnalité permet une vitesse d’acquisition élevée avec un blanchiment drastiquement réduite et la photocytotoxicité. Dans cet article, nous décrivons comment visualiser des cellules immunitaires humaines primaires microscope à lumière-feuille et comment analyser la migration dans un scénario de 3D.

Protocol

Les recherches menées pour la présente étude avec le matériel humain (chambres de système réduction leucocytaire de donneurs de sang humain) sont autorisé par le Comité d’éthique local (déclaration de 16.4.2015 (84/15 ; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) et suit les directives correspondantes. 1. préparation de la Solution de collagène neutralisée (500 µL) Transférer 400 µL de la solution mère de collagène réfrigérés (10,4 mg/mL) dans un tube stérile de 1,5 mL sous …

Representative Results

Formation de saillie au cours de la migration des cellules T est un processus très dynamique, qui est dépendante de l’actine. Pour visualiser la formation de saillie de CTL humain primaire, nous transfectées transitoirement une protéine mEGFP fusionné pour étiqueter le cytosquelette d’actine en CTL comme décrit avant11. Un jour après la transfection, les cellules ont été incorporés dans la matrice de collagène. Piles d’images ont été acquises ch…

Discussion

La plupart des essais in vitro sont réalisées sur une surface 2D, par exemple dans les plaques de culture cellulaire, Pétri ou à lamelles, considérant que l’expérience in vivo des cellules, en particulier les cellules immunitaires, pour la plupart un micro-environnement 3D. Des preuves nouvelles montre que les patrons de migration des cellules immunitaires diffèrent entre 2D et 3D de scénarios17. En outre, les profils d’expression des cellules tumorales sont égalemen…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions l’Institut Hemostaseology clinique et médecine de Transfusion pour la fourniture de sang du donneur ; Carmen Hässig et Cora Hoxha pour l’aide technique excellente. Nous remercions Jens Rettig (Université de la Sarre) pour le vecteur mis à jour le pMAX, Roland Wedlich-Söldner (Université de Münster) pour la construction de LifeAct-Ruby originale et Christian Junker (Université de la Sarre) pour générer la construction LifeAct-mEGFP. Ce projet a été financé par Sonderforschungsbereich 1027 (projet A2 à B.Q.) et 894 (projet A1 à M.H.). Le microscope de lumière-feuille a été financé par la DFG (GZ : FUGG 19-1 INST 256/4).

Materials

Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

References

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Citer Cet Article
Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

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