Здесь мы представляем протокол для поколения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) от синдром ли-Фраумени (LFS) пациента производных фибробластов, дифференциация iPSCs через мезенхимальных стволовых клеток (МСК) остеобластов и моделирование в естественных условиях опухолей с помощью ОРС пациента производные остеобластов.
Синдром ли-Фраумени (ОРС) является расстройством аутосомно-доминирующей Наследственный рак. У больных с ОРС предрасположены к различных типов опухолей, в том числе остеосаркома–один из наиболее частых первичной не гематологических злокачественных новообразований в детство и юность. Таким образом LFS обеспечивает идеальную модель для изучения этой злокачественности. Воспользовавшись iPSC методологий, LFS-связанные остеосаркомы может успешно моделируется дифференциации LFS пациента iPSCs мезенхимальных стволовых клеток (МСК), а затем остеобластов–клетки происхождения для osteosarcomas. Эти LFS остеобластов пилки Онкогенные свойства остеосаркома, предоставляя привлекательные модели системы для разграничения патогенеза остеосаркома. Эта рукопись демонстрирует протокол для генерации iPSCs от ОРС пациента фибробластов, дифференциация iPSCs до MSCs, дифференциация MSCs остеобластов, и в естественных условиях опухолей с помощью ОРС остеобластов. Эта модель iPSC болезни может быть продлен для выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических целей ОРС связанные остеосаркома.
Между 2006 и 2007 годах несколько прорыв результаты из лабораторий Drs. Синъя Яманака и Джеймс а. Томсон привели к развитию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs)1,2,3. Перепрограммирование соматические клетки с определенными транскрипционный анализ факторов формы iPSCs, исследователи смогли генерировать клетки с ключевыми характеристиками, а именно, плюрипотентности и самообновления, которое ранее считалось только существуют в человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). iPSCs могут быть получены из любого лица или пациента и не должны быть получены из эмбрионов, значительно расширяет репертуар имеющихся заболеваний и стола для изучения. С тех пор пациент производные iPSCs были использованы для пилки фенотип различных заболеваний человека, от болезни Альцгеймера4 и боковой амиотрофический склероз5 длинные QT синдром6,7, 8.
Эти достижения в iPSC исследованиях также открыли новые возможности для исследований рака. Несколько групп недавно использовали пациента iPSCs модель развития рака под восприимчивы генетический фон9,10,11, с успешным применением продемонстрировал на сегодняшний день в9остеосаркома, лейкемии10,11,12и13колоректального рака. Хотя рак iPSC производные модели все еще находятся в зачаточном, они продемонстрировали большой потенциал в phenocopying заболевание связанные злокачественных опухолей, изучение патологических механизмов и выявления терапевтических соединений14.
Синдром ли-Фраумени (ОРС) является расстройством аутосомно-доминирующей наследственного рака, вызванных TP53 герминальных мутаций15. У больных с ОРС предрасположены к различных типов злокачественных опухолей, включая остеосаркома, делая LFS iPSCs и их производные клетки особенно хорошо подходит для изучения этого злокачественного16. Модель на основе iPSC остеосаркома был впервые создан в 2015 году, впоследствии с помощью ОРС пациента производные iPSCs9 дифференцированных в мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и затем для остеобластов, возникновение клетки из остеосаркома. Эти LFS остеобластов пилки связанные остеосаркома Остеогенные дифференциация дефектов и Онкогенные свойства, демонстрируя потенциал как «опухоль кости в блюдо» платформа модель. Интересно, что анализ генома общесистемной транскриптом выявить аспекты остеосаркома геном подписи в LFS остеобластов и что функции данного профиля выражение гена ОРС связаны с плохой прогноз в9остеосаркома, указывающее потенциал модели заболеванием iPSCs LFS раскрыть особенности клинической значимости.
Эта рукопись содержит подробное описание о том, как использовать LFS пациента производные iPSCs для модели остеосаркома. В нем подробно поколения LFS iPSCs, дифференциации iPSCs MSCs, а затем, чтобы остеобластов и использование в vivo ксенотрансплантата модели с помощью ОРС остеобластов. LFS болезни модель включает в себя ряд преимуществ, прежде всего способность генерировать неограниченные клетки на всех стадиях развития остеосаркома механистический исследований, биомаркер идентификации и наркотиков скрининг9,14, 16.
Таким образом модель на основе iPSC остеосаркома LFS предлагает привлекательные дополнительные системы для продвижения остеосаркома исследований. Эта платформа также обеспечивает доказательства в концепция для рака моделирования с помощью пациент производные iPSCs. Эта стратегия, описанные ниже может легко распространяться на модель злокачественных опухолей, связанных с другими генетических расстройств с раком предрасположенности.
Для достижения более высокой эффективности MSC дифференциации, некоторые аспекты имеют решающее значение. Один является состояние культуры iPSCs перед началом MSC дифференциации. Протокол, представленный в рукописи основан на предыдущих исследований 9,17. iPSCs…
The authors have nothing to disclose.
Р. з. поддерживается UTHealth инновации для Pre-Doctoral рака профилактики исследований подготовки программы стипендий (профилактика рака и исследовательский институт штата Техас Грант RP160015). Ярно Трулли поддерживается программой КЭ Лин первый аффилированным больница из Sun Yat-sen University. D.-ф.л. CPRIT ученый в области исследований рака и поддерживается NIH путь к независимости премии R00 CA181496 и RR160019 CPRIT премии.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |