Aquí, presentamos un protocolo para la generación de pluripotentes inducidas (iPSCs) de células de fibroblastos derivados pacientes de síndrome de Li-Fraumeni (LFS), diferenciación de iPSCs a través de las células madre mesenquimales (MSCs) y osteoblastos, modelado en vivo tumorigenesis con osteoblastos derivados de paciente LFS.
Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) es un desorden autosómico dominante del cáncer hereditario. Pacientes con LFS están predispuestos a varios tipos de tumores, incluyendo osteosarcoma–una de las malignidades no hematológica primarias más frecuentes en la niñez y adolescencia. Por lo tanto, LFS ofrece un modelo ideal para estudiar esta malignidad. Aprovechando metodologías de iPSC, osteosarcoma LFS-asociada se puede modelar con éxito distinguiendo LFS iPSCs paciente a las células madre mesenquimales (MSCs) y luego a osteoblastos, las células de origen de los osteosarcomas. Estos osteoblastos LFS recapitulan propiedades oncogénicas del osteosarcoma, proporcionando un sistema atractivo modelo para delinear la patogenesia del osteosarcoma. Este manuscrito demuestra un protocolo para la generación de iPSCs de fibroblastos pacientes del LFS, diferenciación de iPSCs para MSCs, diferenciación de MSCs y osteoblastos, en vivo tumorigenesis con osteoblastos LFS. Este modelo de enfermedad de iPSC puede ampliarse para identificar biomarcadores potenciales o dianas terapéuticas para el osteosarcoma LFS-asociado.
Entre 2006 y 2007, varios resultados de avance de los laboratorios de los doctores Shinya Yamanaka y James A. Thomson condujeron al desarrollo de pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células de vástago1,2,3. Por reprogramación de células somáticas con factores transcripcionales definidas forma iPSCs, los investigadores fueron capaces de generar células con características a saber, pluripotencia y auto-renovación, que anteriormente se pensaba que sólo existen en células madre embrionarias humanas (hESCs). iPSCs podría generarse de cualquier individuo o paciente y no tuvo que ser derivado de embriones, ampliando enormemente el repertorio de enfermedades disponibles y fondos para el estudio. Desde entonces, se han utilizado derivados del paciente iPSCs recapitular el fenotipo de varias enfermedades humanas, de la enfermedad de Alzheimer4 y esclerosis lateral amiotrófica5 a largo QT síndrome6,7, 8.
Estos avances en la investigación de iPSC también han abierto nuevas avenidas para la investigación de cáncer. Varios grupos han utilizado recientemente iPSCs paciente al desarrollo de modelos de cáncer en un fondo genético susceptible9,10,11, con aplicación exitosa demostrada hasta la fecha en el osteosarcoma9, leucemia10,11,12y13de cáncer colorrectal. Aunque los modelos de cáncer derivados de iPSC son todavía en su infancia, han demostrado gran potencial en malignidades asociadas a enfermedad phenocopying, elucidar los mecanismos patológicos y la identificación de compuestos terapéuticos14.
El síndrome de Li-Fraumeni (LFS) es un desorden autosómico dominante del cáncer hereditario causado por de mutación de línea germinal TP53 15. Pacientes con LFS están predispuestos a varios tipos de neoplasias malignas como el osteosarcoma, hacer particularmente bien adaptado al estudio de esta malignidad16iPSCs LFS y sus células derivadas. Un modelo basado en iPSC osteosarcoma se estableció en 2015 usando LFS iPSCs derivados del paciente9 posteriormente diferenciadas en células madre mesenquimales (MSCs) y luego a osteoblastos, el que origina las células del osteosarcoma. Estos osteoblastos LFS recapitulan Diferenciación osteogénica osteosarcoma asociado defectos y propiedades oncogénicas, demostrando el modelo potencial como una plataforma de “tumor de hueso en un plato”. Curiosamente, los análisis de genoma transcriptoma revelaron aspectos de una firma de gene de osteosarcoma en osteoblastos LFS y que características de este perfil de expresión génica LFS se correlacionan con mal pronóstico en el osteosarcoma9, indicando la potencial de los modelos de enfermedad de iPSCs LFS para revelar características de relevancia clínica.
Este manuscrito ofrece una descripción detallada de cómo utilizar LFS iPSCs paciente derivado al osteosarcoma de modelo. Detalles de la generación de LFS iPSCs, diferenciación de iPSCs MSCs y luego en osteoblastos y el uso de un modelo de xenoinjerto en vivo utilizando osteoblastos LFS. El modelo de enfermedad LFS cuenta con varias ventajas, en particular la capacidad de generar células ilimitadas en todas las etapas de desarrollo de osteosarcoma de estudios mecanísticos, identificación de biomarcadores y9,14, de detección de drogas 16.
En Resumen, el modelo de base de iPSC osteosarcoma LFS ofrece un atractivo sistema complementario para el avance de la investigación de osteosarcoma. Esta plataforma también proporciona una prueba de concepto para modelado de Cáncer utilizando iPSCs derivados del paciente. Esta estrategia que se describe a continuación puede ampliarse fácilmente a malignidades de modelo asociadas a otros trastornos genéticos con predisposición de cáncer.
Para lograr una mayor eficiencia de la diferenciación de MSC, varios aspectos son críticos. Uno es la condición de la cultura de iPSCs antes de iniciar la diferenciación de MSC. El protocolo presentado en el manuscrito se basa en estudios previos 9,17. iPSCs deben ser cultivadas en MEFs durante al menos 2 semanas. Mantenimiento de iPSCs en buenas condiciones en MEFs son críticas para las células a conectar en la placa de cubierta de gelatina para la diferen…
The authors have nothing to disclose.
R. Z. es apoyado por UTHealth innovación para cáncer prevención formación programa recibió beca de investigación (prevención del cáncer y Research Institute of Texas grant RP160015). J.T. es apoyado por el programa de Ke Lin de la Universidad primera afiliada Hospital de Sun Yat-sen. D. F.L. es el erudito CPRIT en la investigación del cáncer y apoyo de NIH vía independencia Premio R00 CA181496 y CPRIT Premio RR160019.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |