Summary

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

Published: July 04, 2018
doi:

Summary

אינטראקציות מארח-חיידק מעיים היו העריכו באמצעות גישה מוזרה שילוב קהילה אוראלי סינתטי במבחנה במערכת העיכול עיכול, דגם של האפיתל המעי הדק. אנו מציגים שיטה שבה ניתן להתאים כדי להעריך את התא הפלישה של גורמי מחלה, biofilms מינים רב, או אפילו כדי לבדוק את השרידות של פרוביוטיקה ניסוחים.

Abstract

יחסי הגומלין בין המארח microbiota יש כבר הכיר זמן רב, בהרחבה. הפה דומה סעיפים נוספים מערכת העיכול, כפי microbiota תושב מתרחשת ומונע colonisation על ידי חיידקים אקסוגני. ואכן, נמצאו יותר מ-600 מינים של חיידקים בחלל הפה, אדם יחיד יכול לשאת סביב 100 שונים בכל עת. הפה בעל היכולת לדבוק גומחות שונים של המערכת האקולוגית אוראלי, ובכך הופכת משולב בתוך הקהילות מיקרוביאלי תושב, ואת עדיפה עם צמיחה, הישרדות. עם זאת, הזרם של חיידקים לתוך הבטן במהלך בליעה הוצע להפריע את יתרת microbiota הבטן. למעשה, אוראלי מינהל gingivalis פ מוזז קומפוזיציה חיידקי ב ileal microflora. השתמשנו קהילה סינתטיים כמו ייצוג מופשטת של המערכת האקולוגית הטבעית דרך הפה, להבהיר את הישרדות ואת הכדאיות של חיידקים אוראלי חשופים לתנאי המעבר מדומה במערכת העיכול. ארבע עשרה מינים היו שנבחרו, נתון במבחנה הרוק, קיבה, תהליכי העיכול במעיים, הציג מודל תא multicompartment המכיל תאים קאקו-2 ו- HT29-MTX להדמיית בטן האפיתל הרירית. מודל זה שימש כדי לפענח את ההשפעה של החיידקים נבלע על תאים מחזור enterohepatic. באמצעות קהילות סינטטי מאפשר בקירות וצפיות הפארמצבטית. לפיכך, מתודולוגיה זו ניתן להתאים להערכת הכדאיות הפתוגן ושינויים הבאים הקשורים לדלקת, קיבולת קולוניזציה של תערובות פרוביוטיקה, בסופו של דבר, פוטנציאל בקטריאלי להשפיע על מחזור הדם presystemic.

Introduction

בני אדם cohabit עם חיידקים, אשר נמצאים באותו מקום כמו תאים אנושיים1. לפיכך, חשוב קריטיים להשיג הבנה מקיפה microbiome האנושית. חלל הפה הוא סביבה ייחודית בכך הוא מחולק במספר בתי גידול קטן יותר, ובכך המכיל מגוון רחב של חיידקים, biofilms במיקומים שונים אלה. להיות פתוח המערכת האקולוגית, מינים מסוימים בפה יכול להיות המבקרים ארעית. עם זאת, מיקרואורגניזמים מסוימים ליישב מיד לאחר הלידה וצורת מאורגן biofilms2. אלה מצויים על פני השיניים מעל האתר חניכיים, הבקיע subgingival, הלשון, משטחים הרירית, שיניים תותבות, סתימות3. חיידקים ניתן נוכח גם כמו flocs, תאים פלנקטוניים לומן של תעלת השן, או intermixed עם רקמת נמק מוך או הושעה בשלב הנוזלים.

יש קרוס פעיל, רציף-דיבורים בין התאים המארחים את תושב microbiota4. חיידקים תקשורת בתוך ובין מינים, רק אחוז קטן של colonizers טבעי יכול לדבוק רקמות, ואילו חיידקים אחרים לצרף אלה colonizers הראשי. למשל, תא-תא איגוד בין מיקרואורגניזמים הוא מפתח עבור שילוב colonizers משני biofilms אוראלי, ובניית רשתות מורכבות של תאי חיידקים שמעצבת4. בסביבות 70% של אגרגטים חיידקי דגימת רוק בלבד נוצרות על ידי Porphyromonas sp., סטרפטוקוקוס sp., Prevotella sp., Veillonella sp. לא מזוהה Bacteroidetes. פ nucleatum הוא הקולוניאליסט ביניים subgingival biofilm, אגרגטים עם colonizers מאחר gingivalis פ, denticola ט, ו- Tannerella forsythia, אשר אינם מעורבים חניכיים5. בנוסף, סטרפטוקוקוס מיטיס תופסת בתי גידול הרירית והן שיניים, בעוד sanguinis ס ו ס gordonii מעדיפים ליישב שיניים3. לפיכך, sanguinis ס קיים החותכות והתחתון הולכי על ארבע, בעוד Actinomyces naeslundii נמצא anteriors העליון6.

בנוסף, microbiome ילידים ממלאת תפקיד בשמירה על בריאות האדם2. תושב microbiota משתתף בחינוך המערכת החיסונית, מניעת התרחבות הפתוגן. התנגדות colonisation זו מתרחשת כיוון החיידק מקורי עשוי להיות טוב יותר מתאימים הצמדת משטחים, יעיל יותר ב metabolising זמין חומרים מזינים לצמיחה. למרות זנים פרוביוטיקה לשרוד את המעבר במערכת העיכול, להישאר פעילה, התמדתו של חיידקים autochthonous בלע ממיקום העליון של מערכת העיכול לא מלא תואר. לכן, אנחנו חשופים של קהילה מלאכותית, נציג של המערכת האקולוגית אוראלי, לתנאי המעבר מדומה במערכת העיכול. הכדאיות של תאים חיידקיים הוערכה באמצעות דגם multicompartment דמוי האפיתל הבטן. סימולטורים בטן הנוכחיים מציעים הפארמצבטית מתאימים מבחינת ניתוח של הקהילה חיידקים luminal7. עם זאת, אדהזיה חיידקי ואינטראקציה מארח-חיידק בנפרד מטופלות, כמו שילוב של שורות תאים עם קהילות מיקרוביאלי הוא מאתגר8. לעומת זאת, אנו מציגים מסגרת המספקת הסבר מכניסטית פוטנציאלי של אירועים מוצלחים קולוניזציה דיווחו על הממשק בטן. אכן, מודל זה במשותף ניתן עם דגם בטן סטטי כדי להעריך את ההשפעה של קהילות חיידקים על איתות משטח המארח.

Protocol

1. זנים, תרבות תנאים הערה: הקהילה אוראלי סינתטי הולחן על ידי זנים בדרך כלל נוכח אוראלי microbiome3. להשיג זנים הבאים מ אמריקה סוג תרבות אוסף (בקרת האוויר): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (בקרת האוויר 43718), Fusobacterium nucleatum (בקרת האוויר 10953), Porphyromonas gingivalis (ב?…

Representative Results

פרוטוקול זה מוביל הדור של מודל מתאים שחקרתי את הישרדות ואת הכדאיות של חיידקים אוראלי חשופים לתנאי המעבר מדומה במערכת העיכול. הסעיפים של תאים שלמים של זנים בודדים הוא כ 108 תאים מ ל-1 לפני הקמת הקהילה סינתטי, בעוד המיקרוקוסמוס התקדמות הכיל מעל 90% של התאים קיימא במ…

Discussion

Microbiome אוראלי הוא רכיב מפתח בבריאות האדם שדווחו לאחרונה על-ידי מחברים מספר20,21. ממצאים קודמים מראים כי הבליעה של רוק המכיל המון גדול של חיידקים יכולים להשפיע על המערכת האקולוגית מיקרוביאלית של המעי הדק, אשר הוא אחד האתרים המרכזיים עבור המערכת החיסונית תחול. ה…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים להכיר בהכרת תודה התמיכה הכספית מקרן מחקר פלנדריה מרתה Calatayud ארויו (FWO פוסט-דוקטורט במלגת-12N2815N). אמה הרננדז-Sanabria הוא בחור דוקטורט הנתמך על-ידי פלנדריה חדשנות ויזמות (Agentschap voor Innovatie הדלת Wetenschap en Technologie, IWT).

Materials

STRAINS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type Culture Collection ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type Culture Collection ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type Culture Collection ATCC 33277
Prevotella intermedia American Type Culture Collection ATCC 25611
Streptococcus mutans American Type Culture Collection ATCC 25175
Streptococcus sobrinus American Type Culture Collection ATCC 33478
Actinomyces viscosus American Type Culture Collection ATCC 15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R
Streptococcus mitis American Type Culture Collection ATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG Bacteria Collection LMG 14657
Veillonella parvula Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSM 2007
Streptococcus gordonii American Type Culture Collection ATCC 49818
CELL LINES
Caco-2 cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 86010202
HT29-MTX cells European Collection of Authenticated Cell Cultures 12040401
REAGENTS AND CONSUMABLES
Brain Heart Infusion (BHI) broth Oxoid CM1135
Blood Agar 2 Oxoid CM0055 Blood Agar medium
Menadione Sigma M9429
Hemin Sigma H9039
5% sterile defibrinated horse blood E&O Laboratories Ltd, P030
InnuPREP PCRpure Kit Analytik Jena 845-KS-5010250 PCR purification kit
Big Dye Applied Biosystems 4337454 Dye for sequencing
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit Applied Biosystems 4337456
SYBR Green I Invitrogen S7585
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP
T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile VWR 734-2311
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T3924-100ML
Trypan Blue solution
0.4%, liquid, sterile-filtered
Sigma-Aldrich T8154 
PBS Gibco 14190250
DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate Life technologies 31966-047
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts Sigma-Aldrich CLS3450-24EA
Mucin from porcine stomach Type II   Sigma-Aldrich M2378
Inactivated fetal bovine serum Greiner Bio One 758093
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062
Triton X 100 for molecular biology Sigma-Aldrich T8787 
DPBS without calcium, magnesium Gibco 14190-250
Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm Corning Costar Corp 3450
Nuclease-free water Serva Electrophoresis 28539010
EQUIPMENT
Neubauer counting chamber improved Carl Roth T729.1
BD Accuri C6 Flow cytometer BD Biosciences 653118
PowerLyzer 24 Homogenizer MoBio 13155
T100 Thermal Cycler BioRad 186-1096
Flush system Custom made
InnOva 4080 Incubator Shaker New Brunswick Scientific 8261-30-1007 Shaker for 2.10
Memmert CO2 incubator Memmert GmbH & Co. ICO150med
Millicell ERS (Electrical Resistance System) EMD Millipore, Merck KGaA MERS00002
Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system Millipore, Merck KGaA
Shaker (ROCKER 3D basic) IKA 4000000 Shaker for 6.10

References

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533 (2016).
  2. Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
  3. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
  4. Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
  5. Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
  6. Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
  7. Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
  8. Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133 (2014).
  9. Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
  10. Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
  11. Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235 (2017).
  12. Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
  13. Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340 (2018).
  14. Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
  15. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
  16. Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
  17. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
  18. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
  19. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
  20. Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
  21. Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
  22. Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307 (2015).
  23. Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
  24. Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
  25. Kleiveland, C. R., et al., Verhoeckx, K., et al. . The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , 197-205 (2015).
  26. Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
  27. Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
  28. Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).

Play Video

Citer Cet Article
Calatayud Arroyo, M., Van de Wiele, T., Hernandez-Sanabria, E. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (137), e57699, doi:10.3791/57699 (2018).

View Video