Évaluation de la viabilité d’un Consortium bactérien synthétique sur l’Interface hôte-microbe In Vitro Gut
Summary
Interactions hôtes-microorganismes gut ont été évaluées à l’aide d’une nouvelle approche combinant une communauté orale synthétique, in vitro digestion gastro-intestinale et un modèle de l’épithélium de l’intestin grêle. Nous présentons une méthode qui peut être adaptée pour évaluer l’invasion des cellules des agents pathogènes et des biofilms multi-espèces, ou même de tester la capacité de survie des probiotiques formulations.
Abstract
L’interaction entre l’hôte et de la flore microbienne a été reconnue depuis longtemps et largement décrite. La bouche est semblable à d’autres sections du tractus gastro-intestinal, comme résident microbiote se produit et empêche la colonisation par des bactéries exogènes. En effet, plus de 600 espèces de bactéries sont trouvent dans la cavité buccale, et une seule personne peut transporter environ 100 différents à tout moment. Bactéries orales possèdent la capacité de respecter les divers créneaux dans l’écosystème par voie orale, donc s’intégrer dans les communautés microbiennes et qui favorise la croissance et la survie. Cependant, le débit des bactéries dans l’intestin lors de la déglutition a proposé à perturber l’équilibre de la microflore intestinale. En fait, l’administration orale de P. gingivalis décalé la composition bactérienne de la microflore iléale. Nous avons utilisé une communauté synthétique comme une représentation simplifiée de l’écosystème naturel par voie orale, pour élucider la survie et la viabilité des bactéries orales soumises à des conditions de transit gastrointestinal simulée. Quatorze espèces ont été sélectionnés, soumis à in vitro salivaires, gastriques et les processus de la digestion intestinale et présentés à un modèle de cellule compartiments contenant des cellules Caco-2 et HT29-MTX pour simuler l’épithélium muqueux du tube digestif. Ce modèle a servi à éclaircir l’impact des bactéries avalés sur cellules impliquées dans la circulation entéro-hépatique. À l’aide des communautés synthétiques permet de contrôlabilité et reproductibilité. Ainsi, cette méthode peut être adaptée pour évaluer la viabilité de l’agent pathogène et les changements ultérieurs associée à l’inflammation, la capacité de colonisation des mélanges de probiotiques, et en fin de compte, bactérien potentiel impact sur la circulation presystemic.
Introduction
Les êtres humains cohabitent avec des bactéries qui sont présentes sur le même nombre que les cellules humaines1. Donc, il importe de crucial afin d’obtenir une compréhension globale du microbiome humain. La cavité buccale est un environnement unique, car il est divisé en plusieurs petits habitats, donc contenant une grande variété de bactéries et de biofilms dans ces différents endroits. Étant un écosystème ouvert, certaines espèces dans la bouche peut être transitoires visiteurs. Toutefois, certains micro-organismes colonisent peu après que la naissance et la forme organisée de biofilms2. Ceux-ci sont présents dans la surface des dents au-dessus de la crevasse gingivale, la crevasse sous-gingival, muqueuses et prothèses dentaires et de garnitures3. Les bactéries peuvent également être présents comme les flocons et les cellules planctoniques dans la lumière du canal dentaire, soit mélangés entre eux avec tissu de pulpe nécrotique ou en suspension dans une phase fluide.
Il est active et continue la diaphonie entre les cellules de l’hôte et la microflore résidente4. Les bactéries communiquent au sein et entre les espèces, et seule une faible proportion des colonisateurs naturels peut adhérer aux tissus, tandis que les autres bactéries attachent à ces colonisateurs primaires. Par exemple, liaison de cellules entre micro-organismes est la clé pour intégrer les colonisateurs secondaires biofilms par voie orale et construction de réseaux complexes d’interaction des cellules microbiennes4. Environ 70 % des agrégats bactériens dans un échantillon de salive sont formés par Porphyromonas SP., Streptococcus SP., Prevotella SP., Veillonella SP. et non identifiés Bacteroidetes. F. nucleatum est un colonisateur intermédiaire dans le biofilm sous-gingival et agrégats avec les colonisateurs fin P. gingivalis, T. denticola et Tannerella forsythia, qui sont impliqués dans la parodontite5. En outre, Streptococcus mitis occupe les habitats les muqueuses et dentaires, tandis que S. sanguinis et S. gordonii préfèrent à coloniser les dents3. Ainsi, S. sanguinis est présente dans moins incisives et canines, Actinomyces naeslundii a retrouvé en dents antérieures supérieures6.
En outre, le microbiome autochtone joue un rôle dans le maintien de la santé humaine2. Microbiote résident participe à l’éducation immunitaire et pour prévenir l’expansion de l’agent pathogène. Cette résistance de colonisation se produit parce que les bactéries indigènes peuvent être mieux adaptés à attacher aux surfaces et plus efficace à la métabolisation des nutriments disponibles pour la croissance. Bien que les souches probiotiques survivent le passage gastro-intestinal et restent actives, la persistance de bactéries autochtones avalé d’une situation supérieure du tube digestif n’a pas été entièrement décrit. Ainsi, nous avons soumis une communauté artificielle, représentant de l’écosystème par voie orale, aux conditions du transit gastro-intestinal simulée. La viabilité des cellules bactériennes a été évaluée en utilisant un modèle de compartiments ressemblant à l’épithélium du tube digestif. Simulateurs de gut actuel offrent reproductibilité adaptée en termes d’analyse de la communauté microbienne luminale7. Cependant, adhérence bactérienne et l’interaction hôte-microbe séparément s’adressent, comme la combinaison de lignées cellulaires avec des communautés microbiennes est difficile8. En revanche, nous présentons un cadre qui fournit une explication mécaniste potentielle de colonisation réussie rapportées sur l’interface de l’intestin. En effet, ce modèle peut être utilisé conjointement avec un modèle statique gut pour évaluer l’impact des communautés microbiennes sur signalisation surface hôte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le microbiome oral est un élément clé dans la santé humaine, comme l’a récemment rapportée par plusieurs auteurs20,21. Résultats antérieurs indiquent que l’ingestion de la salive contenant de grosses charges de bactéries peut influencer l’écosystème microbien de l’intestin grêle, qui est l’un des principaux sites pour amorcer la pompe système immunitaire. La combinaison d’un modèle de la digestion gastro-intestinale supérieure statique …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le soutien financier de la Fondation de recherche de Flandre à Marta Calatayud Arroyo (FWO postdoctoral fellowship-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria est doctorant pris en charge par la Flandre Innovation et entrepreneuriat (Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie, transport fluvial).
Materials
| STRAINS | |||
| Aggregatibacter actinomycetemcomitans | American Type Culture Collection | ATCC 43718 | |
| Fusobacterium nucleatum | American Type Culture Collection | ATCC 10953 | |
| Porphyromonas gingivalis | American Type Culture Collection | ATCC 33277 | |
| Prevotella intermedia | American Type Culture Collection | ATCC 25611 | |
| Streptococcus mutans | American Type Culture Collection | ATCC 25175 | |
| Streptococcus sobrinus | American Type Culture Collection | ATCC 33478 | |
| Actinomyces viscosus | American Type Culture Collection | ATCC 15987 | |
| Streptococcus salivarius TOVE-R | |||
| Streptococcus mitis | American Type Culture Collection | ATCC 49456 | |
| Streptococcus sanguinis | BCCM/LMG Bacteria Collection | LMG 14657 | |
| Veillonella parvula | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures | DSM 2007 | |
| Streptococcus gordonii | American Type Culture Collection | ATCC 49818 | |
| CELL LINES | |||
| Caco-2 cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 86010202 | |
| HT29-MTX cells | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 12040401 | |
| REAGENTS AND CONSUMABLES | |||
| Brain Heart Infusion (BHI) broth | Oxoid | CM1135 | |
| Blood Agar 2 | Oxoid | CM0055 | Blood Agar medium |
| Menadione | Sigma | M9429 | |
| Hemin | Sigma | H9039 | |
| 5% sterile defibrinated horse blood | E&O Laboratories Ltd, | P030 | |
| InnuPREP PCRpure Kit | Analytik Jena | 845-KS-5010250 | PCR purification kit |
| Big Dye | Applied Biosystems | 4337454 | Dye for sequencing |
| ABI Prism BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337456 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7585 | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| T25 culture flasks uncoated, cell-culture treated, vented, sterile | VWR | 734-2311 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Trypan Blue solution 0.4%, liquid, sterile-filtered |
Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS | Gibco | 14190250 | |
| DMEM cell culture media, with GlutaMAX and Pyruvate | Life technologies | 31966-047 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3450-24EA | |
| Mucin from porcine stomach Type II | Sigma-Aldrich | M2378 | |
| Inactivated fetal bovine serum | Greiner Bio One | 758093 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Triton X 100 for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DPBS without calcium, magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 88953 | |
| Corning HTS Transwell-24 well, pore size 0.4 µm | Corning Costar Corp | 3450 | |
| Nuclease-free water | Serva Electrophoresis | 28539010 | |
| EQUIPMENT | |||
| Neubauer counting chamber improved | Carl Roth | T729.1 | |
| BD Accuri C6 Flow cytometer | BD Biosciences | 653118 | |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | MoBio | 13155 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 186-1096 | |
| Flush system | Custom made | – | |
| InnOva 4080 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | 8261-30-1007 | Shaker for 2.10 |
| Memmert CO2 incubator | Memmert GmbH & Co. | ICO150med | |
| Millicell ERS (Electrical Resistance System) | EMD Millipore, Merck KGaA | MERS00002 | |
| Millipore Milli-Q academic, ultra pure water system | Millipore, Merck KGaA | – | |
| Shaker (ROCKER 3D basic) | IKA | 4000000 | Shaker for 6.10 |
References
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