Questo protocollo fornisce un approccio conveniente per isolare e caratterizzare del mouse primario cellule tubolari renali che possono successivamente essere sub-coltivate per valutare funzioni biologiche renale ex vivo, tra cui bioenergetiche mitocondriali.
La disfunzione mitocondriale nelle cellule epiteliali tubolari renali (TECs) può condurre a fibrosi renale, delle principali cause di malattia renale cronica (CKD). Pertanto, la valutazione della funzione mitocondriale in TECs primaria possono fornire informazioni preziose sullo stato bioenergetico delle cellule, fornendo la comprensione nella patofisiologia di CKD. Mentre ci sono una serie di complessi protocolli disponibili per l’isolamento e la purificazione dei tubuli prossimali in specie diverse, il campo manca un metodo conveniente ottimizzato per isolamento delle cellule tubolari senza bisogno di purificazione. Qui, forniamo un protocollo di isolamento che consente per studi focalizzati su entrambi primaria del mouse TECs renale prossimale e distale. Oltre alla convenienti reagenti e minimale animale procedure necessarie in questo protocollo, le cellule isolate mantengono alti livelli di energia dopo l’isolamento e possono essere sub-coltivate fino a quattro passaggi, consentendo continui studi. Inoltre, utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare elevato throughput, valutiamo la respirazione mitocondriale direttamente nel TECs isolato in una piastra a 96 pozzetti per i quali forniamo consigli per l’ottimizzazione della densità delle cellule e la concentrazione di composti. Queste osservazioni suggeriscono che questo protocollo può essere usato per gli studi di tubolare renale ex vivo con una produzione coerenza, ben standardizzato di renale TECs. Questo protocollo può avere più ampie applicazioni future di studiare la disfunzione mitocondriale associata a disturbi renali per scoperta della droga o droga caratterizzazione scopi.
Funzione delle cellule epiteliali tubolari renali (TEC) è fortemente associata con la condizione generale di salute del rene. Segnalazione patologiche nel rene causa il dedifferentiation di TECs, che svolge un ruolo importante nella fibrosi del rene e renale cronica (CKD) la malattia1,2. Come un organo altamente energetico, il rene è secondo solo al cuore nel consumo di ossigeno, principalmente attraverso la fosforilazione ossidativa mitocondriale3. Studi di microscopia elettronica hanno rivelato una correlazione positiva dei cambiamenti morfologici mitocondriali di eventi patologici in tubuli renali4. La disfunzione mitocondriale in TECs provoca fibrosi renale attraverso transizione epiteliale di mesenchymal5 e difettoso dell’acido grasso ossidazione6. La fibrosi è una patologia renale progressiva che si traduce in CKD. Quindi, comprendere lo stato energetico di TECs renale è una necessità di scoprire la patofisiologia di CKD.
Ci sono tipi cellulari > 20 nel rene adulto7. Per studiare la funzione di TECs, una coltura primaria di cellule epiteliali renali è necessaria come una piattaforma per applicazioni di biologia molecolare come trattamenti chimici e manipolazioni genetiche. D’importanza, manipolazioni genetiche possono essere fatto in vivo in topi tramite transgenesi o utilizzando AAV gene consegna tecniche8 in modo che le cellule primarie isolate sarebbe già essere manipolate geneticamente. L’isolamento delle cellule tubolari renali primari da topi9,10, ratti11,12,13, canini14, conigli15,16e gli esseri umani17 ,18 è stato segnalato con fasi di purificazione per produrre cellule tubolari prossimali pure. In questi protocolli precedentemente pubblicati che si concentrano sull’isolamento delle cellule tubolari prossimali, centrifugazione su gradiente e l’ordinamento di esperimenti sono stati effettuati per fini di purificazione19. Mentre questi protocolli sono preziosi per lo studio di tubuli prossimali, essi non sono sufficienti quando tubuli sia prossimali e distali sono necessari per essere studiato. Ad esempio, il nostro studio sulla sindrome di Alport ha rivelato che sia prossimali che distali tubuli renali svolgono un ruolo importante nella progressione malattia20, e di conseguenza entrambi i tipi di tubuli renali dovrebbero essere studiati nella cultura. Un recente studio sulla tossicità del fluoruro renale inoltre ha mostrato che le mutazioni patologiche ha avuto luogo in entrambi i tubuli prossimali e distali21. Di conseguenza, questo protocollo di isolamento è progettato e ottimizzato per cellule tubulari distale e prossimale da reni del mouse con un costo minimo di reagenti e semplici procedure. In alternativa, gli investigatori possono ancora seguire il protocollo fino al punto 3.1 e aggiungere purificazione passaggi9 da questo punto in avanti per l’isolamento delle cellule tubolari prossimali pure.
Le cellule isolate presentano alti livelli energetici e mantengono caratteristiche epiteliali renali dopo le sub-culture a 4 passaggi. Utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare elevato throughput, valutiamo la respirazione mitocondriale direttamente nel TECs isolato in una piastra a 96 pozzetti, che porta a ulteriori approfondimenti in ottimizzazione di densità cellulare. Queste osservazioni suggeriscono che questo protocollo può essere applicato agli studi di tubolare renale ex vivo con una produzione coerenza, ben standardizzato di renale TECs. Un ulteriore significato del presente protocollo è suo uso fattibile come uno strumento di alto rendimento per la caratterizzazione di ex vivo della bioenergetica mitocondriale in cellule tubolari renali prossimali e distali. Di conseguenza, può servire come una piattaforma per la scoperta della droga o droga tra gli scopi di caratterizzazione dei disordini renali.
Abbiamo ottimizzato un protocollo che consente per l’efficiente isolamento delle cellule epiteliali tubolari renali del mouse (TECs) e ha mostrato che le cellule possono essere sub-coltivate per un’analisi di flusso extracellulare valutare la respirazione mitocondriale in presenza di acido grasso- e/o substrati a base di glucosio. Questo protocollo è progettato per studi focalizzati su cellule tubulari distale e prossimale e funge da quadro con cui costruire esperimenti più complessi per la comprensione delle malattie renali associati a patologia TEC. Rispetto ai protocolli precedentemente pubblicati9,10,19, questo metodo non richiede gradiente separazioni con lunghi tempi di centrifugazione o l’utilizzo di un anticorpo ampio per l’ordinamento e, pertanto, offre una più Guida efficiente e ottimizzato per i ricercatori che lavorano nel campo metabolico tubolare renale. Ci sono diversi passaggi critici nel presente protocollo, tra cui la digestione, nuova collezione e densità di placcatura e ottimizzazione composto per il dosaggio di flusso extracellulare.
Scelta del tipo corretto di collagenasi e concentrazione ottimale è la chiave per un successo digestione e dissociazione delle cellule tubulari da tessuti renali. Rispetto ad altri tipi di collagenasi, collagenasi tipo 2 contiene i livelli relativamente elevati di attività della proteasi, in grado di dissociare strutture compatte renale. Per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione a causa di una prolungata di aspersione e tempi di digestione, 0,013% collagenasi di tipo 2 è stato irrorato a 30 mL/min. La capsula renale è stato rimosso solo dopo che entrambi i reni sono state raccolte dall’animale e trasferiti in una cappa di cultura cellulare sterilizzato. I reni sono stati macinati in piccoli pezzi e hanno continuato la loro incubazione con 10 mL di un tampone di digestione per un altro 5 min per una digestione completa e il massimo rilascio delle cellule tubulari.
Anche se, dopo la digestione, la sospensione di tessuto viene passata attraverso un filtro da 70 µm per rimuovere i pezzi di tessuto molto grande, ci sarà ancora non digeriti tubuli che passano attraverso il filtro e soggiorno all’interno della sospensione cellulare e ottenere piastrate su piastra di coltura. Ci vuole un tempo più lungo rispetto al normale per questi tubuli rilasciare cellule tubulari e fissare saldamente la piastra di coltura. Di conseguenza, è piuttosto importante raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare per pellet i tubuli non collegati e cellule il secondo giorno dopo la placcatura di cella. Questo passaggio di centrifugazione a bassa velocità ulteriormente rimuove altri tipi di cellule che sono più leggeri di cellule tubulari e consente unattached tubuli e cellule tubulari a stabilirsi.
L’identificazione di densità adeguata delle cellule è il primo e fondamentale passo per un’analisi di flusso extracellulare successo. I risultati hanno mostrato che 40.000 cellule per pozzetto su una micropiastra XF96 è ideale per cellule primarie tubolare in un acido grasso e un test di respirazione a base di glucosio (Figura 3). In questo protocollo, isolate cellule tubolari sono state utilizzate per l’analisi di flusso extracellulare ai passaggi 1 e 2. Le cellule Sub-coltivate di per passaggio 3, anche se hanno mantenuto un’espressione di marcatori tubolari (Figura 2) e un rendimento decente nelle analisi bioenergetica (Figura 3A) e hanno mostrato livelli di respirazione basale in diminuzione rispetto al passaggio 2 (mostrato confrontando OCR nei pannelli a destra della Figura 3A di Figura 3). Questa diminuzione non può influire sostanzialmente sano delle cellule tubulari (ad esempio, quelli isolati dai giovani topi wild-type). Tuttavia, per gli studi su cellule isolate da modelli murini CKD che già hanno una diminuita la respirazione mitocondriale, passaggi superiore delle cellule possono causare una diminuzione ulteriore nella respirazione basale che comprometterebbe i risultati del dosaggio flusso extracellulare. Negli studi condotti qui, le cellule dal passaggio 1 e passaggio 2 hanno mostrato alto livelli di respirazione basale. Pertanto, a seguito di questo protocollo, si consiglia di utilizzare questi due primi passi per gli studi di respirazione mitocondriale con cellule isolate da animali sani e malati. Cellule dal passaggio 2 dovrebbero ancora tener conto se la sub-cultura passaggio 1 non produce cellule sufficienti per il dosaggio di flusso. Oltre agli studi di bioenergetica, la nostra ricerca precedente dimostra che TECs primario al passaggio 3 può essere estremamente utile per i trattamenti con composti seguite da proteine e RNA studi (dati non mostrati). Detto questo, suggeriamo che gli investigatori usando questo protocollo per isolare cellule tubulari dovrebbero scegliere con attenzione il passaggio ottimo per applicazioni di ricerca diversi.
Il principio di funzionamento dell’analisi flusso extracellulare è basato sulle interazioni tra i composti iniettati e i complessi di catena di respirazione e l’effetto del disaccoppiatore. Oligomycin è un inibitore del complesso V (ATP sintasi) ed è usato per distinguere il consumo di ossigeno legata all’ATP e il consumo di ossigeno che è necessaria per superare la perdita regolare protoni attraverso una membrana interna mitocondriale32. FCCP disgiunge il consumo di ossigeno dalla produzione di ATP interrompendo il potenziale di membrana mitocondriale. Così, esso fornisce una misura della capacità massima respirazione come aggira la limitata capacità di un efflusso di ioni del protone di trifosfato di adenosina synthase permettendo un trasporto di protoni attraverso la membrana. Antimycin-A, un inibitore del complesso III e rotenone, un complesso mi blocco, vengono utilizzati in combinazione per arrestare la respirazione mitocondriale intera permettendo una differenziazione tra il mitocondriale contro il consumo di ossigeno non mitocondriale in le cellule. Questi composti dovrebbero sempre essere titolati per uno specifico tipo cellulare prima del dosaggio di flusso extracellulare determinare le concentrazioni ottimale che producono le curve di OCR ottimale. Qui, si consiglia di 1 µM di oligomycin, 1 µM di FCCP e 2 µM di rotenone/antimycin A per il dosaggio di flusso extracellulare il primario TECs.
In conclusione, questo protocollo fornisce un modo semplice e conveniente per isolare primarie prossimali e distali cellule epiteliali tubolari renali che possono essere utilizzate per la valutazione bioenergetica mitocondriale ex vivo. Mentre questo protocollo può essere utile in una vasta gamma di studi di biologia molecolare ad esplorare la funzione biologica delle cellule epiteliali tubolari renali, riconosciamo i limiti quando applicarlo agli studi che necessitano di Puri tubuli prossimale o distale. Ad esempio, studi sulla sindrome di Lowe, una disfunzione tubolare prossimale selettiva33o studi sull’acidosi tubolare renale distale, una disfunzione tubolare distale34, richiederebbe un protocollo più sofisticato per isolamento delle cellule e purificazione. Tuttavia, per la maggior parte degli studi che confrontano tubuli vs glomeruli e per gli studi allo schermo potenziali regolatori di respirazione mitocondriale nelle cellule tubolari in generale, il protocollo prevede un approccio fattibile elevato throughput. Pertanto, il presente protocollo può avere vaste applicazioni per studiare la disfunzione mitocondriale associata a disturbi renali per scopi di convalida di scoperta o destinazione di droga.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni per Lina A. Shehadeh: il National Institute of Health (R56HL132209 e 1R01HL140468) e l’Istituto di ricerca del cuore di Miami.
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |