Denne protokol giver en omkostningseffektiv tilgang for at isolere og karakterisere mus primær renal tubulær celler, der kan efterfølgende sub kulturperler for at vurdere renal biologiske funktioner ex vivo, herunder mitokondrie bioenergetik.
Mitokondriel dysfunktion i renal tubulær epitelceller (TECs) kan føre til nyre fibrose, en væsentlig årsag til kronisk nyresygdom (Cementovnstøv). Derfor kan vurdere mitokondrie funktion i primære TECs give værdifuld indsigt i de celler, giver indsigt i Patofysiologi af Cementovnstøv bioenergetic status. Mens der er en række komplekse protokoller til isolering og oprensning af proksimale tubuli i forskellige arter, mangler feltet en omkostningseffektiv metode optimeret til rørformede celle isolation uden behov for rensning. Her, leverer vi en isolation-protokol, der giver mulighed for undersøgelser med fokus på både primær mus proksimale og distale renal TECs. Ud over omkostningseffektive reagenser og minimal animalske procedurer, der kræves i denne protokol, de isolerede celler opretholde høje energi niveauer efter isolation og kan være sub kulturperler op til fire passager, giver mulighed for løbende undersøgelser. Derudover vurderer bruger en høj overførselshastighed ekstracellulære flux analyzer, vi den mitokondrielle respiration direkte i de isolerede TECs i en 96-brønd plade som vi give anbefalinger til optimeringen af celle tæthed og sammensatte koncentration. Disse observationer tyder på, at denne protokol kan bruges til renal tubulær ex vivo undersøgelser med en konsekvent, godt standardiseret produktion af renal TECs. Denne protokol kan have bredere fremtidige programmer at studere mitokondriel dysfunktion associeret med nyre lidelser for drug discovery eller narkotika karakterisering formål.
Renal tubulær epitelcelle (TEC) funktion er stærkt forbundet med den generelle helbredstilstand i nyrerne. Patologisk signalering i nyrerne forårsager dedifferentiation af TECs, som spiller en stor rolle i nyre fibrose og kronisk nyre sygdom (Cementovnstøv)1,2. Som en meget energisk orgel er nyrerne kun overgået af hjerte i forbrug af ilt, primært gennem mitokondrie oxidativ fosforylering3. Elektronmikroskopi undersøgelser har vist en positiv korrelation af mitokondrie morfologiske ændringer til patologisk begivenheder i de renale tubuli4. Mitokondriel dysfunktion i TECs forårsager renal fibrose gennem epitelial til mesenchymale overgangen5 og defekte fedtsyre oxidation6. Fibrose er en progressiv renal patologi, der resulterer i Cementovnstøv. Forstå den energiske status af renal TECs er derfor en nødvendighed at afdække Patofysiologi af Cementovnstøv.
Der er > 20 celletyper i voksen nyre7. For at studere funktionen af TECs, er en primær kultur af renal epitelceller nødvendig som en platform for molekylær biologi applikationer såsom kemiske behandlinger og genetiske manipulationer. Vigtigere, kan genetiske manipulationer gøres i vivo på mus via transgenese eller ved hjælp af AAV gen levering teknikker8 , så de isoleret primærelementer ville allerede være genetisk manipuleret. Isolering af primær renal tubulær celler fra mus9,10, rotter11,12,13, hjørnetænder14, kaniner15,16, og mennesker17 ,18 er blevet rapporteret med rensning trin til give ren proksimal tubulær celler. I disse tidligere publicerede protokoller, at fokusere på isolering af proksimal tubulær celler, blev gradient centrifugering og sortering eksperimenter udført for rensning formål19. Mens disse protokoller er værdifulde for at studere proksimale tubuli, er de ikke tilstrækkelige, når både proksimale og distale tubuli er nødvendige for at blive undersøgt. For eksempel, har vores undersøgelse på Alport syndrom afsløret at både proksimale og distale renal tubuli spiller en vigtig rolle i sygdom progression20, og derfor begge former for de renale tubuli bør undersøges i kultur. En nylig undersøgelse på renal fluorid toksicitet viste også, at patologiske ændringer fandt sted i både den proksimale og distale tubuli21. Denne isolation protokol er derfor designet og optimeret til både proksimale og distale rørformede celler fra mus nyrerne med en minimal omkostning af reagenser og enkle procedurer. Alternativt kan efterforskere stadig følge protokollen indtil trin 3.1 og tilføje rensning trin9 fra dette punkt fremad til isolering af ren proksimal tubulær celler.
De isolerede celler præsentere høj energiske niveauer og vedligeholde renal epitelial egenskaber efter sub-kulturer til 4 passager. Ved hjælp af en høj overførselshastighed ekstracellulære flux analyzer, vurderer vi den mitokondrielle respiration direkte i de isolerede TECs i en 96-brønd plade, hvilket fører til yderligere indsigt i celle tæthed optimering. Disse observationer tyder på, at denne protokol kan anvendes til renal tubulær ex vivo undersøgelser med en konsekvent, godt standardiseret produktion af renal TECs. En ekstra betydning af denne protokol er dens mulige anvendelse som en høj produktivitet redskab til ex vivo karakterisering af mitokondrie bioenergetik i renal proksimale og distale rørformede celler. Derfor kan det tjene som en platform for drug discovery eller narkotika karakterisering formål af nyre lidelser.
Vi optimeret en protokol, der giver mulighed for effektiv isolering af musen renal tubulær epitelceller (TECs) og viste, at cellerne kan være sub kulturperler til en ekstracellulær flux analyse at evaluere mitokondrie respiration i overværelse af fedtsyre- og/eller glucose-baseret substrater. Denne protokol er udviklet til undersøgelser med fokus på både proksimale og distale rørformede celler og fungerer som en ramme til at bygge mere komplekse eksperimenter for forståelsen af TEC patologi-associerede nyresygdomme. I forhold til tidligere publicerede protokoller9,10,19, denne metode kræver ikke gradient separationer med lang centrifugering gange eller en rigelig antistof brug for sortering og, derfor, tilbyder en mere effektiv og optimeret guide for forskere, der arbejder i den renal tubulær metaboliske felt. Der er flere vigtige skridt i denne protokol, herunder fordøjelse, fornyet samling, og plating tæthed og sammensatte optimering for ekstracellulære flux assay.
Valg af den korrekte type af collagenase og optimal koncentration er nøglen til en vellykket fordøjelse og dissociation af rørformede celler fra nyre væv. Sammenlignet med andre typer af collagenases, indeholder type 2 collagenase relativt højere niveauer af protease aktivitet, i stand til at adskille kompakt renal strukturer. For at minimere risikoen for forurening som følge af en langvarig perfusion og fordøjelsestid, var 0,013% type 2 collagenase perfunderet på 30 mL/min. Den renale kapsel var kun fjernet efter begge nyrer blev høstet fra dyret og overføres til en steriliseret celle kultur hætte. Nyrerne blev hakket i små stykker og fortsatte deres inkubering med 10 mL af en fordøjelsen buffer til en anden 5 min for en komplet fordøjelse og maksimal frigivelse af de rørformede celler.
Selvom efter fordøjelsen, væv suspension er passeret gennem en 70 µm filter til at fjerne meget store væv stykker, vil der stadig være ufordøjet tubuli, der passerer gennem filteret og holde sig inden for cellesuspension og få belagt på kultur parabol. Det tager længere tid end normalt for disse tubuli at frigive rørformede celler og Vedhæft fast til fadet, kultur. Derfor, er det temmelig vigtigt at indsamle cellesuspension og centrifugeres at pellet løstliggende tubuli og celler andendagen efter celle plating. Trinnet lav hastighed centrifugering yderligere fjerner andre celletyper, der er lysere end rørformede celler og giver mulighed for separate tubuli og rørformede celler til at bilægge.
Identifikation af ordentlig celle tæthed er det første og vigtigste skridt for en vellykket ekstracellulære flux assay. Resultaterne viste, at 40.000 celler pr. brønd på en XF96 mikrotiterplade er ideel til primære rørformede celler i både en fedtsyre og en glucose-baseret respiration assay (figur 3 c). I denne protokol, blev isolerede rørformede celler brugt til den ekstracellulære flux assay på passager 1 og 2. Cellerne sub kulturperler for at passage 3, selv om de opretholdt et udtryk for de rørformede markører (figur 2) og en anstændig ydelse i bioenergetik assays (figur 3A), og viste nedsat basal respiration niveauer i forhold til passage 2 (vist ved at sammenligne OCR i panelerne længst til højre i figur 3A til figur 3 c). Dette fald kan ikke påvirke væsentligt sund rørformede celler, (for eksempel dem isoleret fra unge wild-type mus). Dog til undersøgelser på celler isoleret fra Cementovnstøv musemodeller, der allerede har en formindsket mitokondrie respiration, kan højere passager af celler forårsage et yderligere fald i den basale respiration, hvilket ville påvirke resultaterne af ekstracellulære flux assay. I undersøgelserne, der udføres her, celler fra både passage 1 og passage 2 viste høj basal respiration niveauer. Efter denne protokol anbefaler vi derfor, bruge disse to tidlige passager til mitokondrie respiration undersøgelser med celler isoleret fra både raske og syge dyr. Celler fra passage 2 bør stadig tages i betragtning, hvis passage 1 sub-kultur ikke giver tilstrækkelig celler til flux assay. Ud over bioenergetik undersøgelser viser vores tidligere forskning, at primære TECs på passage 3 kan være meget nyttige for behandlinger med forbindelser efterfulgt af proteiner og RNA undersøgelser (data ikke vist). Når det er sagt, foreslår vi at Efterforskere bruge denne protokol til at isolere rørformede celler omhyggeligt bør vælge den optimale passage til forskellige applikationer.
Funktionsprincip af ekstracellulære flux analyse er baseret på interaktioner mellem de injicerede forbindelser og respiration kæde komplekser og effekten af uncoupler. Oligomycinets er en hæmmer af komplekse V (ATPsyntase) og bruges til at skelne ATP-linked iltforbrug og iltforbrug, der er nødvendige for at overvinde den regelmæssige proton læk over mitokondriets indre membran32. FCCP uncouples iltforbrug fra ATP produktion ved at forstyrre den mitokondrielle membran potentiale. Således, det giver en måling af maksimal respiration kapacitet som det omgår den begrænsede kapacitet af en proton ion efflux af ATPsyntase ved at tillade en proton transport gennem membranen. Antimycin-A, en kompleks III hæmmer, og rotenon, en kompleks jeg blocker, der anvendes i kombination hen til nedlægge den hele mitokondrie respiration at tillade en differentiering mellem den mitokondrielle vs. ikke-mitokondrie iltforbrug i cellerne. Disse forbindelser bør altid titreres til en bestemt celletype før ekstracellulære flux analysen til at bestemme de optimale koncentrationer, der giver de optimale OCR kurver. Her, anbefaler vi 1 µM af oligomycinets, 1 µM af FCCP og 2 µM af rotenon/antimycin A for ekstracellulære flux analysen på primære TECs.
Til sidst, giver denne protokol en enkel og omkostningseffektiv måde at isolere renal primære proksimale og distale rørformede epitelceller der kan bruges til vurdering af mitokondrie bioenergetik ex vivo. Mens denne protokol kan være nyttigt i en lang række molekylærbiologiske undersøgelser at udforske den biologiske funktion af renal tubulær epitelceller, erkender vi sine begrænsninger, når du anvender det til undersøgelser har brug for ren proksimale eller distale tubuli. For eksempel, undersøgelser på Lowe syndrom, en selektiv proksimal tubulær dysfunktion33eller undersøgelser på distale renal tubulær acidose, en distal rørformede dysfunktion34, ville kræve en mere avancerede protokol for celle isolation og rensning. Men for størstedelen af de undersøgelser, der sammenligner tubuli vs glomeruli, og studier til at screene potentielle mitokondrie respiration lovgivere i rørformede celler i almindelighed, protokollen giver en gennemførlig høj overførselshastighed tilgang. Derfor kan denne protokol har bredt programmer at studere mitokondriel dysfunktion associeret med nyre lidelser for drug discovery eller target valideringsformål.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af de følgende tilskud til Lina A. Shehadeh: den National Institute of Health (R56HL132209 og 1R01HL140468) og Miami hjerte Research Institute.
Collagen I Rat Protein, Tail | ThermoFisher Scientific | A1048301 | |
Acetic Acid | J.T.Baker | 9508 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Renal Epithelial Cell Growth Medium 2 Kit | PromoCell | C-26130 | |
2-Deoxy glucose | Sigma | D6134 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
L-Carnitine | Sigma | C0283 | |
Etomoxir | Sigma | E-1905 | |
Oligomycin | Sigma | 75351 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Antimycin-A | Sigma | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Sodium palmitate | Sigma | P9767 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
DMEM powder | Sigma | D5030-1L | |
Hoechst 33342 | LifeTechnologies | H3570 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | LifeTechnologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Micro Dissecting Forceps | Roboz | RS-5101 | |
TC10 automated cell counter | Bio-Rad | 506BR2119 | |
MINIPULS 3 Peristaltic Pump | Gilson Inc. | GM3P | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Seahorse Bioscience | S7800A | |
Seahorse XFe96 FluxPack (includes sensor cartridges, microplates, and calibrant) | Seahorse Bioscience | 10260-100 |