CRISPR/Cas9 유전자 인간 말라리아 기생충의 조건부 돌연변이 게 P. falciparum 에 편집
Summary
우리 glmS생성 하는 방법에 설명- 변형 체 falciparum 게놈 편집 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 최저의 돌연변이 체를 기반으로.
Abstract
말라리아 병 적 상태와 사망률 전세계의 중요 한 원인입니다. 주로 열 대와 아열대 지역에 그 생활에 영향을 미치는,이 질병은 변형 체 기생충 감염에 의해 발생 합니다. 전투 말라리아에 더 효과적인 약물의 개발이 복잡 한 기생충의 생물학의 우리의 이해를 개선 하 여 가속 될 수 있다. 이 기생충의 유전자 조작; 그들의 생물학을 이해 하는 열쇠 이다 그러나, 역사적으로의 P. falciparum 게놈이 되었습니다 조작 하기 어려운. 최근, CRISPR/Cas9 게놈 편집 태그, 조건부 단백질 knockdowns의 생성 및 유전자의 삭제 쉽게 단백질에 대 한 허용 하는 말라리아 기생충에 이용 되어 있다. CRISPR/Cas9 게놈 편집 말라리아 연구의 분야를 발전을 위한 강력한 도구가 될 입증 되었습니다. 여기, 우리가 glmS생성 하는 CRISPR/Cas9 방법 설명- P. falciparum에 조건부 최저의 돌연변이 기반으로. 이 메서드는 매우 다른 종류의 유전자 조작, 단백질 태그를 포함 하 여 및 유전자 녹아웃에 적응할 수 있습니다.
Introduction
말라리아 속 변형 체의 protozoan 기생충에 의해 발생 하는 치명적인 질병 이다. P. falciparum, 대부분 치명적인 인간 말라리아 기생충 51세 미만의 아이 들에서 주로 년 당 약 445,000 사망자를 발생합니다. 변형 체 기생충 모기 벡터와 척추와 관련 된 복잡 한 라이프 사이클 있다. 인간은 먼저 감염 된 모기는 혈액 식사 때 감염 될. 그런 다음, 기생충 어디 그것은 성장, 발전 하 고 분할 약 1 주일 간 침공. 이 과정 후, 기생충은 어디 그들이 받을 성적 복제 적혈구 (Rbc)에 혈 류로 발표 됩니다. Rbc 내 기생충의 성장을 직접 말라리아2와 관련 된 임상 증상에 대 한 책임이 있습니다.
최근까지, 유전자 변형 P. falciparum 에의 생산 힘 드는 과정, 몇 달 동안을 했다 하 고 높은 고장율을 했다 약물 선택의 여러 라운드를 포함 했다. 이 시간이 걸리는 절차 relieson 무작위 DNA의 세대 나누기 관심 영역에 비록 그것의 게놈을 고쳐야 하는 기생충의 내 생 능력 동종 수리3,,45,6 . 최근, 클러스터 정기적으로 Interspaced 구조 반복/Cas9 (CRISPR/Cas9) 게놈 편집은 성공적으로 이용 되어 P. falciparum7,8. 말라리아 연구에서이 새로운 기술의 도입이 치명적인 변형 체 기생충의 생물학의 이해를 발전에 대 한 중요 한 되었습니다. CRISPR/Cas9 가이드 동종 관심사의 유전자는 RNAs (gRNAs)을 통해 유전자의 특정 대상에 대 한 수 있습니다. GRNA/Cas9 복잡 한 gRNA를 통해 유전자 인식 하 고 Cas9 다음 유기 체9,10수리 메커니즘의 개시를 강제로 이중 가닥 브레이크 소개. P. falciparum 복구 비 동종 끝에 합류를 통해 DNA 나누기 기계 부족, 때문에 그것은 동종 재결합 메커니즘을 활용 하 고 Cas9/gRNA-유도 복구 동종 transfected DNA 템플릿을 통합합니다 두 배 물가 틈11,12.
여기, 선물이 프로토콜 P. falciparum 에 조건부 최저의 돌연변이의 발생을 위한 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용 하 여. 프로토콜에는 PfHsp70x의 조건에 따라 최저 단백질 수준 glmS ribozyme의 사용 방법을 보여 줍니다 (PF3D7_0831700)는 보호자 여 내보낸 P. falciparum 호스트에 Rbc13,14. GlmS ribozyme 다니엘의 관련된 mRNA, 단백질14에 있는 감소에 지도를 (어떤 셀에 글루코사민-6-인산으로 변환 됩니다) 글루코사민 치료 활성화 됩니다. 이 프로토콜 불안 도메인 또는 RNA aptamers4,,515등 다른 조건부 최저의 도구 활용을 쉽게 적응 될 수 있다. 우리의 프로토콜 내용을 조류 (HA) 태그와 glmS ribozyme 코딩 시퀀스 시퀀스에 의해 형벌의 구성 된 수리 플라스 미드의 세대는 동종 PfHsp70x 열려있는 독서 프레임 (ORF)와 3′-UTR에 있습니다. 우리는 또한 드라이브 식는 gRNA의 두 번째 플라스 미드의 생성을 설명합니다. 드라이브 Cas9의 표현 제 3 함께 이러한 두 개의 플라스 미드는 Rbc로 페 고 P. falciparum 기생충의 게놈을 수정 하는 데 사용. 마지막으로, 우리는 연쇄 반응 (PCR) 기술-태그와 glmS ribozyme의 통합을 확인 하는 기술을 기반으로. 이 프로토콜은 수정 이나 말라리아 기생충의 생물학에 새로운 통찰력을 생성 하는 우리의 기능을 강화, 어떤 P. falciparum 유전자의 완전 한 녹아웃에 대 한 높은 적응력입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 P. falciparum 에 구현은 모두의 효율성을 증가 하 고 기생충의 게놈, 유전자 조작의 이전 방법에 비해 수정에 필요한 시간을 감소. 이 포괄적인 프로토콜 P. falciparum에 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 조건부 돌연변이 생성에 필요한 단계를 설명 합니다. 여기 방법은 하-glmS 돌연변이의 발생을 위해 특별히 기어 드,이 전략의 다양 한 요구, 유전자, 유전자 녹아웃 그리고 점 돌연변이…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 조지아 대학 (UGA) 생물 현미경 핵심 기술 지원 Muthugapatti Kandasamy와 호세 후안 로페즈-루비 오 pUF1 Cas9 및 pL6 플라스 미드를 공유 하기 위한 감사. 이 작품 호 재단 수상 D.W.C. 하 고 H.M.K.에 의해 지원 되었다 UGA 시작 자금 V.M., V.M., 그리고 미국 국립 보건원에 천 재단 (바 질 오 코너 스타터 학술 연구 상)의 3 월에서에서 보조금을 부여 (R00AI099156 및 R01AI130139) V.M. 하 고 (T32AI060546) H.M.K.를
Materials
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
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