作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集
Summary
GlmSを生成する手法について述べる-熱帯熱マラリア原虫CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用して条件付きノックダウン変異体を用いた。
Abstract
マラリア罹患率と死亡率の世界の重要な原因であります。主に熱帯および亜熱帯地域に住んでいる人に影響を与える、この病気は、原虫の感染が原因です。マラリアと闘うためにより効果的な薬の開発は、この複雑な寄生虫の生物学の私達の理解を改善することによって加速することができます。これらの寄生虫の遺伝子操作の生物学を理解する鍵は、します。しかし、歴史的にマラリアのゲノムが難しかった操作します。最近では、容易に蛋白質のタグ付け、条件付きタンパク質ノックダウンの発生と遺伝子の削除を可能にするマラリア原虫に CRISPR/Cas9 ゲノム編集を利用されています。CRISPR/Cas9 ゲノム編集はマラリア研究の分野を進めるための強力なツールであると証明しました。ここで、 glmSを生成するための CRISPR/Cas9 手法について述べる-基づくマラリアでノックダウン変異体条件付き。このメソッドは、適応性の高いタンパク質タグを含む、遺伝子操作、遺伝子のノックアウトの他のタイプです。
Introduction
マラリアは、マラリア原虫属原虫によって引き起こされる壊滅的な病気です。マラリア、ほとんど致命的な人間のマラリア原虫の 51歳未満の子供を中心に、年間約 445,000 死亡を原因します。原虫媒介蚊と脊椎動物のホストを含む複雑なライフ サイクルがあります。人間最初に感染感染した蚊は吸血します。その後、寄生虫はどこに成長、成長して約 1 週間分割肝を侵入します。このプロセスの後、寄生虫は赤い血球 (赤血球) の無性複製を受ける血流に解放されます。赤血球内寄生虫の成長はマラリア2に関連付けられている臨床症状の直接責任があります。
最近まで、トランスジェニックマラリアの生産は、何ヶ月かかったし、高い故障率があった医薬品の選択のいくつかのラウンドを含む、骨の折れるプロセスをだった。この時間のかかる手順 relieson 関心領域とそのゲノムをも修復する寄生虫の内因性の能力ランダム DNA の世代改相同修理3,4,5,6.最近では、クラスター化された定期的に空間回文繰り返し/Cas9 (CRISPR/Cas9) ゲノム編集活用されている正常にマラリア7,8。マラリア研究のこの新しい技術の導入は、これらの致命的な原虫の生物学の理解を進めるために重要されています。CRISPR/Cas9 ガイド Rna (gRNAs) 興味の遺伝子に相同性のある遺伝子の特定の目標が可能です。GRNA/Cas9 複雑な認識、gRNA、遺伝子、Cas9 は、生物9,10の修復メカニズムの開始を強制二重鎖切断を紹介します。マラリア非相同末端結合を介して DNA 切断修復する機械に欠けている、のでそれは相同組換え機構を利用し、Cas9/gRNA 誘導を修復する transfected 相同 DNA テンプレートを統合二重鎖切断11,12。
ここでは、プロトコルを提案マラリアでノックダウン変異体条件の世代の CRISPR/Cas9 ゲノム編集を使用しています。PfHsp70x の条件付きでノックダウン蛋白質のレベルにglmSリボザイムの使用するプロトコルを示します (PF3D7_0831700)、シャペロンによってエクスポートされたマラリアのホストに赤血球13,14。GlmSリボザイムはグルコサミン (これは細胞のグルコサミン-6-リン酸に変換する) 処理によるタンパク質14の削減につながる、その関連付けられている mRNA を切断するアクティブになります。このプロトコルは、不安定化ドメインまたは RNA アプタマー4,5,15などの他の条件のノックダウン ツールを活用する簡単に適合できます。我々 のプロトコルの詳細コーディング シーケンス シーケンスが並ぶヘマグルチニン (HA) タグとglmSリボザイムから成る修理プラスミドの世代のある PfHsp70x オープンリーディング フレーム (ORF) と 3′ UTR に相同性です。ドライブ式、gRNA の 2 番目のプラスミッドの世代についても述べる。これら 2 種のプラスミド、Cas9 の式を駆動する第三と一緒に、赤血球にトランスフェクションし、マラリア寄生虫のゲノムを変更するために使用します。最後に、我々 はポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を記述する-ベース タグとglmSリボザイムの統合を確認する手法です。このプロトコルは、変更または強化してマラリア原虫の生物学に新しい洞察力を生成する任意のマラリア遺伝子の完全なノックアウトの小回りです。
Protocol
Representative Results
Discussion
マラリアに CRISPR/Cas9 の実装が両方の効率を高め、寄生虫のゲノム、遺伝子操作の以前の方法と比較してを変更するために必要な時間の量を減少します。この包括的なプロトコルでは、マラリアに CRISPR/Cas9 を使用して条件付き変異体を生成するために必要な手順について説明します。ここにメソッドは、具体的には HAglmS変異体の世代向け、この戦略多様なニーズ、遺伝子?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PUF1 Cas9 と pL6 プラスミドを共有、技術支援のためジョージアの大学 (UGA) 生体顕微鏡コア Muthugapatti Kandasamy とホセ フアン ・ ロペス ・ ルビオ監督に感謝します。この作品は v. m. v. m.、および米国国立衛生ダイム財団 (バジル ・ オコナー スターター学者研究賞) の 3 月から助成金に UGA スタートアップ資金を付与円弧財団賞 D.W.C. と H.M.K.、によって支えられた (R00AI099156 とR01AI130139) 参加して (T32AI060546) H.M.K. に
Materials
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. . World Malaria Report. , (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
