מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאפשר כימות מדויק של מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA). ב פרוטוקול זה, אנו מתארים של עיכול אנזימטי של DNA עם BamHI בשילוב עם צינור ניתוח bioinformatic אשר יכול לשמש כדי למנוע מופרזת של רמות מתילציה mtDNA שנגרם למבנה mtDNA משני.
Abstract
כימות של מתילציה DNA יכולה להיות מושגת באמצעות רצף ביסולפאט, אשר מנצל המאפיין של ביסולפיט להמרת ציטוזין unmethylated אורציל, בהקשר דנ א חד גדילי. רצף ביסולפאט יכול להיות ממוקד (באמצעות PCR) או לבצע על הגנום כולו ומספק כימות מוחלטת של ציטוזין מתילציה ברזולוציה-הבסיס יחיד. בהתחשב באופי ברורים של DNA גרעיני – ו מיטוכונדריאלי, ובייחוד במבנה משני, adaptions של ביסולפאט שיטות רצף על חקירת ציטוזין מתילציה ב mtDNA צריכה להיעשות. מבנה משניות ושלישוניות mtDNA יכול בהחלט להוביל ביסולפאט רצף חפצים שמוביל שווא-תוצאות חיוביות בשל גישה המסכן דנטורציה לא שלם של ביסולפאט ל- DNA חד-גדילי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות עיכול אנזימטי של ה-DNA BamHI יחד עם bioinformatic ניתוח צינור כדי לאפשר כימות מדויק של ציטוזין מתילציה רמות ב mtDNA. בנוסף, אנו מספקים הנחיות לעיצוב תחל רצף ביסולפאט ספיציפית mtDNA, כדי להימנע מיקוד מקטעי הגרעיני מיטוכונדריאלי לא רצויים (NUMTs) מוכנס לתוך הגנום הגרעיני.
Introduction
גנום מיטוכונדריאלי הוא מבנה כפול גדילי מעגלית של-16.5-קילו base (kb), המהוות של כבד, ופיסה אור. גנום מיטוכונדריאלי נוכח מספר עותקים בתוך כל תא, maternally-בירושה, ו מקודד מרכיבים חיוניים של קומפלקסי שרשרת הנשימה1. בדומה הגנום חיידקי, בניגוד הגנום הגרעיני, גנום מיטוכונדריאלי מאורגן במבנים רבים משניות ושלישוניות, כגון מבנים מפותל supercoiled2, אשר יכול לגמול גישה קשה במהלך רצף ניסויים3.
בגרעין, מתילציה של הדנ א היא סימן epigenetic בהרחבה למדה משחק תפקיד בתהליכים רבים, ובמיוחד בוויסות של ביטוי גנים. מתילציה DNA הגנום יונקים, מתרחשת בעיקר על 5-מיקום הטבעת פירימידין של deoxycytidines, בעיקר על CG dinucleotides (או CpG). מתילציה ציטוזין נמצא ב-70% של CpG כל הגנום של תאים סומטיים וחשבונות ~ 1% של סך שה-DNA בסיסים4. ה-DNA methylations בכללותה תוארה גם בהקשרים שאינם-CpG, כגון רו ח, CpT עלות לקליק, קיים בכמויות שונות ב- DNA גרעיני, עם ערכים עד 25% של כל cytosines מפוגל בתאי גזע עובריים5,6,7.
בעוד ציטוזין מתילציה של הגנום הגרעיני מקובל, קיום מיטוכונדריאלי מתילציה DNA (mtDNA) הוא עדיין שנוי במחלוקת. המחקר הראשון מתילציה חוקר mtDNA בוצעה בתאים בתרבית איפה mtDNA מתילציה זוהה בקלות, למרות ברמות נמוכות בהשוואה ל- DNA גרעיני8. בתאים אנושיים וטכנולוגיים מאתר, mtDNA מתילציה זוהה גם ברמות נמוכות (2-5%). באמצעות מבחני להסתמך על לכידת 5 methylcytosine כגון מפוגל immunoprecipitation דנ א (MeDIP) ואחריו PCR כמותי, mtDNA מתילציה זוהה גם מגוון העכבר של האדם ואת תאי שורות9,10, 11,12. באמצעות נוגדנים נגד 5-methylcytosine assay אליסה או ספקטרומטר מסה, רמות משמעותי של מתילציה DNA אובחנו שברים מיטוכונדריאלי מטוהרים13,14,15, 16. עם זאת, רוב מבחני במחקרים הנ ל משמש טכניקות לא תוכננו כדי לספק כימות מוחלטת של מתילציה DNA ברזולוציה-הבסיס יחיד.
ניתוח מתילציה של הדנ א resolutive וסטטיסטי יכולה להיות מושגת על ידי טכניקה בשם “ביסולפאט רצף”, אשר מנצל המאפיין של ביסולפיט להמרת ציטוזין unmethylated אורציל חד גדילי הדנ א בהקשר17 . באמצעות רצף ביסולפאט, מערך של מחקרים זיהה את הנוכחות של ציטוזין מתילציה ברמות שונות. מתילציה mtDNA באזור D לופ, את 12S או האזור מטוסי אף-16 זוהה ברצון האנושי18,19,20,21,22,23 ו העכבר24 רקמות ותאים, לעומת זאת, עם השתנות מסקרן, 1-20% של סך cytosines על פני לימודי.
לעומת אלה מחקרים רבים, יש רק מעט מחקרים, כולל הקבוצה שלנו, השנויות במחלוקת על הימצאות mtDNA מתילציה3,25,26,27 או חקרו את הרלוונטיות הביולוגי של רמות נמוכות מאוד של רמות (להלן 2%) mtDNA28. לאחרונה, דווח כאן את ההתבוננות חפץ ביסולפאט-רצף פוטנציאליים ביסולפאט מיטוכונדריאלי כל רצף3. סיפקנו ראיות מבנה שניוני של דנ א מיטוכונדריאלי יכול להוביל תוצאות חיוביות שגויות ב רצף ביסולפאט, ובכך מפריז מתילציה רמות. אנו מספקים כאן פרוטוקול כדי למנוע חפץ של ביסולפאט-המרה של mtDNA. פרוטוקול זה משתמש של עיכול אנזימטי פשוטה של ה-DNA כדי לשבש mtDNA משני מבנים ולאפשר גישה מלאה ביסולפאט בעקבות ביסולפאט רצף פרוטוקול. בנוסף, אנו מספקים של צינור bioinformatic הנלווים לניתוח של רצף ביסולפאט.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול ביסולפאט-רצף אשר היא תוכננה במיוחד כדי לחקור mtDNA מתילציה. ההבדלים עם ביסולפאט-רצפי פרוטוקולים המשמשים עבור הדנ א טמון הניצול של צעד עיכול אנזים הגבלה מוקדמת, ניתוח bioinformatic פסק דין החוצה שווא חיוביים. הנובעות NUMT רצפים.
אנו מספקים פרוטוקול כדי להימנע ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המרכז קרן נובו נורדיסק מחקר מטבולית בסיסית היא מרכז מחקר עצמאי ב אוניברסיטת קופנהגן חלקית במימון של תרומה בלתי מוגבלת של הקרן נובו נורדיסק.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D’Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down’s syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -. M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. . Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. The BiSearch web server. BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
