Summary
Hier presenteren we een protocol zodat nauwkeurige kwantificering van mitochondriale methylation van DNA (mtDNA). In dit protocol beschrijven we een enzymatische spijsvertering van DNA met BamHI in combinatie met een bioinformatic analyse pijpleiding die kan worden gebruikt om te voorkomen dat overschatting van mtDNA methylering niveaus veroorzaakt door de secundaire structuur van mtDNA.
Abstract
Kwantificering van methylation van DNA kan worden bereikt met behulp van bisulfiet sequencing, die profiteert van de eigenschap van natrium bisulfiet unmethylated cytosine omzetten in uracil, in een context van single-stranded DNA. Bisulfiet sequencing kan worden gericht (met behulp van PCR) of uitgevoerd op het hele genoom en biedt absolute kwantificering van cytosine Methyleren aan de enkele base-resolutie. Gezien de verschillende aard van nucleaire- en mitochondriaal DNA, met name in de secundaire structuur, moeten aanpassingen van bisulfiet sequencing methoden voor onderzoek van cytosine methylering in mtDNA worden gemaakt. Secundaire en tertiaire structuur van mtDNA kan inderdaad leiden tot bisulfiet artefacten leidt tot vals-positieven te wijten aan de slechte toegang onvolledig denaturatie van bisulfiet naar single-stranded DNA sequencing. Hier beschrijven we een protocol met behulp van een enzymatische spijsvertering van DNA met BamHI in combinatie met bioinformatic analyse pijpleiding om nauwkeurige kwantificering van cytosine methylering niveaus in mtDNA. Bovendien, wij bieden richtlijnen voor het ontwerpen van het Bisulfiet sequencing primers specifiek voor mtDNA, (NUMTs) ingevoegd om te voorkomen dat ongewenste nucleaire mitochondriale segmenten richten het nucleair genoom.
Introduction
Het mitochondriaal genoom is een circulaire, double-stranded structuur van ongeveer 16,5-kilo base (kb) lang, die deel uitmaken van een zware en een lichte onderdeel. Het mitochondriaal genoom is aanwezig in meerdere exemplaren binnen elke cel, maternally-geërfd, en codeert van essentiële componenten van de respiratoire keten complexen1. Gelijkaardig aan bacteriële genoom en in tegenstelling tot het nucleair genoom, het mitochondriaal genoom is georganiseerd in talrijke secundaire en tertiaire structuren, zoals in opgerolde en supercoiled structuren2, die toegang tijdens sequencing bemoeilijken kan experimenten-3.
In de kern is methylation van DNA een uitgebreid bestudeerde epigenetische teken dat een rol in tal van processen, met name in de regulatie van genexpressie speelt. Methylation van DNA doet zich voor in zoogdieren genomen, hoofdzakelijk op de 5-positie van de pyrimidine-ring van deoxycytidines, meestal op CG dinucleotides (of APR). Cytosine methylering komt voor bij 70% van alle apr in het genoom van somatische cellen en ~ 1% van het totaal dat DNA bases4. DNA-methyleringen is ook beschreven in niet-CpG contexten, zoals CpC, CpA en CpT en bestaan in verschillende hoeveelheden in nucleaire DNA, met waarden van maximaal 25% van alle methylated cytosines in embryonale stamcellen5,6,7.
Terwijl cytosine methylering van het nucleair genoom is geaccepteerd, is het bestaan van mitochondriale methylation van DNA (mtDNA) nog steeds controversieel. De eerste studie behandelende mtDNA methylering werd uitgevoerd in gekweekte cellen waar mtDNA methylering gemakkelijk waargenomen is, hoewel op een lager niveau in vergelijking met nucleaire DNA8. In zowel menselijke als lymfkliertest cellen, werd mtDNA methylering ook ontdekt op een laag niveau (2-5%). Met behulp van tests te vertrouwen op 5 methylcytosine vangen zoals gemethyleerd DNA immunoprecipitation (MeDIP) gevolgd door kwantitatieve PCR, mtDNA methylation is ook aangetroffen in verschillende muis en mens en cellen lijnen9,10, 11,12. Met behulp van antilichamen tegen 5-methylcytosine in een ELISA-test of de massaspectrometrie, werden aanzienlijke niveaus van methylation van DNA ontdekt van gezuiverde mitochondriale breuken13,14,15, 16. de meeste van de tests in de bovengenoemde studies echter gebruikt technieken die niet zijn ontworpen voor een absolute kwantificering van methylation van DNA op de enkele base-resolutie.
Kwantitatieve en ontbindende methylation van DNA analyse kan worden bereikt door een techniek genaamd "bisulfiet sequencing", die profiteert van de eigenschap van natrium bisulfiet unmethylated cytosine omzetten in uracil in single-stranded DNA context17 . Met bisulfiet sequencing, is een constellatie van studies de aanwezigheid van cytosine Methyleren aan verschillende niveaus geconstateerd. Methylation mtDNA in de D-loop-regio, de 12S of de 16S-regio is gemakkelijk waargenomen in menselijke18,19,20,21,22,23 en muis24 weefsels en cellen, echter met een intrigerende variabiliteit, van 1-20% van de totale cytosines over studies.
In vergelijking met die talrijke studies hebben alleen een paar studies, met inbegrip van onze fractie, betwist de aanwezigheid van mtDNA methylering3,25,26,27 of vraagtekens bij de biologische relevantie van zeer lage niveaus van mtDNA niveaus (onder 2%)28. Onlangs meldden we de waarneming van een potentiële bisulfiet-sequencing artefact in hele mitochondriale bisulfiet sequencing3. We aangetoond dat de secundaire structuur van mitochondriaal DNA kan leiden tot valse positieven in bisulfiet sequencing, waardoor overschatting van methylering niveaus. Wij bieden hier een protocol om te voorkomen dat een artefact van Bisulfiet-Omzetting van mtDNA. Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudige enzymatische spijsvertering van DNA te verstoren mtDNA secondaire structuren en volledige toegang toe tot bisulfiet volgens een bisulfiet sequencing protocol. Daarnaast bieden wij een begeleidende bioinformatic pijpleiding voor de analyse van bisulfiet sequencing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. restrictie-enzym behandeling
- Linearize mtDNA door de behandeling van de totale menselijke DNA met de restrictie-enzym BamHI, dat op positie 14258 in de menselijke mitochondriaal DNA snijdt.
Opmerking: Voor muis DNA, gebruikt u de restrictie-enzym BglII onder identieke omstandigheden zoals hieronder. - Voor elk monster waar mtDNA methylering is om te worden beoordeeld, bereiden van één 0,2 mL reactiebuis en toevoegen van de volgende mix: 3 μg genomic DNA (gekwantificeerd door fluorometry), 15 μL Buffer 3, 3 μL BamHI en water tot van 150 μl
- Plaatsen van de buizen in een thermische cycler gedurende 4 uur bij 37 ° C.
2. Bisulfiet Omzetting
- BamHI-behandelde DNA met behulp van natrium bisulfiet zoals elders beschreven29converteren.
- 200-500 ng BamHI-behandelde DNA gebruiken voor elke reactie van de conversie in een totaal volume van 20 μL. Het DNA-herstel is 50-70%.
- Elueer de DNA bisulfiet-omgezet in 10 μL elutie buffer.
- Kwantificeren van de single-stranded DNA door fluorometry.
- Optioneel: Slaan bisulfiet-geconverteerde DNA bij-20 ° C alvorens de rest van het protocol. Voor langdurige opslag, opslaan bisulfiet-geconverteerde DNA bij-80 ° C
3. ontwerp van bisulfiet Sequencing Primers
- Het ontwerpen van inleidingen voor bisulfiet sequencing met behulp van de online hulpmiddelen Methprimer30 en3231,BiSearch.
Nota: Methprimer en BiSearch toestaan te zoeken voor primer bindende opeenvolgingen in genomic opeenvolgingen waar cytosines worden omgezet in thymines, op dezelfde manier tot na bisulfiet behandeling. - Voor optimale en onbevooroordeelde versterking, Vermijd apr dinucleotides in de inleidingen en de grootte van de amplicon tussen 100-300 bp ontwerpen.
- Ervoor zorgen dat ontworpen primers specifiek voor het mitochondriaal DNA met BiSearch de functie Primer zoeken. Plaats de reeds ontworpen bisulfiet geconverteerd inleidingen, Vink het vakje bisulfiet en omvatten een verwijzing genoom en PCR parameters.
Opmerking: Een lijst van mogelijke PCR producten worden getoond. - Kopieer de top 1-5 primer sequenties en plak ze in een bestelformulier voor oligonucleotide synthese.
Opmerking: Een lijst van mens en muis mtDNA primer sequenties die is gevalideerd in het laboratorium wordt weergegeven in tabel 1. - Test inleidingen met behulp van bisulfiet geconverteerd PCR na agarose gelelektroforese zoals beschreven in stap 4. Test en optimaliseren van alle primerparen afzonderlijk en controleer dat de grootte van de juiste amplicon wordt weergegeven op de agarose gel.
Opmerking: Als multiplexing inleidingen nodig zijn, toevoegen meerdere inleidingen op een single van PCR reactie en visualiseren van de PCR producten op agarose gelelektroforese of, op een meer ontbindende methode zoals polyacrylamide gelelektroforese, te onderscheiden van vergelijkbare producten grootte.
4. bisulfiet geconverteerd PCR en Gel extractie
- Uitvoeren om te versterken van de regio's van belang, PCR met behulp van een warme start Taq polymerase. Kort, mix 100 ng geconverteerd DNA, 500 µM gevoel en anti-gevoel inleidingen, 1 µL dNTP mix (10 µM van elke dNTP) en polymerase op 7.5 U/reactie in een totaal volume van 50 µL. PCR uitvoeren met de volgende voorwaarden: 5 min bij 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C)
35 cycli; 10 min 72 ° C. Inleidingen hetzij afzonderlijk gebruiken of multiplex. - Optioneel: Wanneer multiplexing inleidingen, gebruik 200 ng geconverteerd DNA en fietsen oorzaken: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 cycli; 10 min 72 ° C.
Opmerking: De temperatuur kan variëren afhankelijk van de smelttemperatuur van inleidingen. - Onderwerp PCR producten gel elektroforese op 2% agarose op 100 volt.
- Onder zachte UV-licht, pak van PCR producten met een scalpel en toevoegen aan slangen. Niet blootstellen PCR producten aan buitensporige UV-licht om DNA-schade te voorkomen. Vermijd blootstellingstijd meer dan 30 s.
- De PCR-producten met behulp van gel zuivering zoals eerder beschreven3zuiveren.
- Kwantificeren van de gezuiverde DNA uit stap 4.5 met behulp van fluorometry. Gaat u verder met stap 5 of winkel monsters bij-20 ° C.
35 cycli; 10 min 72 ° C. Inleidingen hetzij afzonderlijk gebruiken of multiplex.5. bisulfiet Sequencing bibliotheek voorbereiding
- Bibliotheek bereiding van bisulfiet-geconverteerde PCR producten uitvoeren.
Optioneel: multiplex PCR producten in dit stadium. - Einde-reparatie met behulp van maximaal 100 uitvoeren ng van PCR product. 3 µL einde prep enzym en 6.5 µL einde reparatie reactie buffer (10 x) toevoegen aan 55,5 µL PCR product in een 0,2 mL-buis. Plaats en incubeer buis in een thermische cycler gedurende 30 minuten bij 20 ° C, gevolgd door 30 minuten bij 65 ° C.
- Sequencing adapters afbinden door het mengen van de einde-gerepareerd DNA met 15 µL Blunt/TA ligase mix, 2.5 µL adapter en 1 µL afbinding versterker. Als met behulp van < 100 ng PCR product als input, Verdun adapter 10 keer.
- Plaats van de mix (stap 5.3) in een thermische cycler en incubeer 15 min bij 20 ° C. De thermische cycler onderbreken en voeg 3 µl gebruiker enzym aan de buis. Mengen en plaats de buis terug in de thermische cycler en incubeer 15 min bij 37 ° C.
- Grootte selecteren het DNA adapter-afgebonden met vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) kralen met verschillende verhoudingen van kralen aan DNA afhankelijk van de grootte van PCR product.
- 13.5 µL H2O aan adapter-afgebonden DNA uit stap 5.4 en 55 µL geresuspendeerde SPRI kralen toevoegen. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min en plaats buis op een magnetische voet. Wanneer de oplossing duidelijk is, het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en negeren van de buis met de kralen.
Opmerking: Het supernatant bevat het DNA adapter-afgebonden en grote ongewenste fragmenten zijn gebonden aan de afgedankte kralen. - Vanuit stap 5.6 25 µL geresuspendeerde SPRI kralen toevoegen aan het supernatant, meng en laat 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Plaats de buis op de magnetische stand en verwijder het supernatant wanneer de oplossing duidelijk is.
Opmerking: De verwijderde supernatans bevat ongewenste DNA, terwijl de adapter-afgebonden DNA is gebonden aan kralen. - Terwijl de buis op de magnetische stand is, voeg toe 200 µL 80% ethanol (vers bereid) om te wassen van de kralen. Incubeer 30 s en verwijderen en negeren de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap voor een totaal van 2 wasbeurten.
- Lucht droog kralen voor 5 min terwijl de buis op magnetische stand met een open deksel is.
- Verwijderen van de buis van de magneet, Elueer van het DNA in 23 µL elutie buffer en meng. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
- Plaats de buis op een magnetische standaard en als de oplossing duidelijk is, 2 µL overbrengen in een 96-Wells PCR plaat voor de pre-PCR versterking (stap 5.14).
- Breng de rest ongeveer 21 µL tot een nieuwe 0,2 mL koker voor PCR versterking (stap 5.17).
Opmerking: Zorg dat niet alle kralen overdragen zoals kralen enzymatische reacties van volgende stappen kunnen remmen. - Ga door naar stap 5.14 of winkel monsters bij-20 ° C.
- Uitvoeren van pre-PCR versterking door RT-qPCR te schatten het aantal cycli dat nodig om de adapter-afgebonden DNA te vergroten. Per reactie toevoegen de volgende handelingen uit in de 96-Wells-PCR plaat met 2 µL DNA (stap 5.11): 0.4 µL Index primer 0.4 µL universele PCR primer, 7.2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR master mix.
- Plaats de plaat in een real-time PCR-machine en de plaat die aan de volgende voorwaarden onderworpen: 30 bij 98 ° C s (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 cycli; 5 min 65 ° C.
- Schatten van het aantal cycli van versterking nodig voor elk monster door een Ct-waarde met de Ct-waarden van de versterking van de pre-RT-qPCR overeenkomt met het einde van de lineaire fase van de PCR reactie af te trekken.
- De adapter-afgebonden DNA uit stap 5.12 versterken door het mengen van: 21 µL DNA, 25 µL PCR master mix, 1 µL Index primer, 1 µL universele PCR primers en 2 µL H2O. In een thermische cycler, elke steekproef aan de volgende voorwaarden onderworpen: 30 bij 98 ° C s (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [berekende Ct vanaf stap 5.16] cycli; 5 min 65 ° C.
Opmerking: Vergeet niet om slechts één Index primer per monster om multiplexing mogelijk te maken. De index wordt ingevoegd tijdens de PCR. - Zuiveren van de versterkte DNA SPRI-kralen en elueer in 22 µL elutie buffer.
- Controle van bibliotheek kwaliteit door gel elektroforese of alternatieve methode. Zoek naar de juiste bibliotheek piek maten (PCR product grootte plus adapter).
- Schatting van de gemiddelde basenpaar grootte van de bibliotheek product(en) door uitstrijkje analyse: In geavanceerde globale instellingen, dubbelklik op "tabel" onder uitstrijkje analyse. De regio van 100-1000 bp definiëren en klik op OK. Onder Regio tabelde gedefinieerde regio verschijnt en gemiddelde grootte van de bibliotheek (bp) wordt berekend.
- Kwantificeren bibliotheken door fluorometry. Gaat u verder met stap 6 of winkel bibliotheken bij-20 ° C.
6. volgende generatie Sequencing
- Bereken de concentratie van de nM van bibliotheken met behulp van de formule:
- Verdun bibliotheken aan de dezelfde nM concentratie BV 2 nM (Kies 4 nM, 2 nM, 1 nM, of 0,5 nM afhankelijk van concentraties van de bibliotheek). Het zwembad van alle bibliotheken om een pool van 2 nM bibliotheken.
- Denatureren en Verdun bibliotheken na de sequencing instrument gids. Kortom: de 2 nM zwembad denatureren door toevoeging van 0,2 N NaOH en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Dilute het gedenatureerde zwembad tot een uiteindelijke verdunning van 10 pM. Denatureren en Verdun een verkrijgbare Control library naar een uiteindelijke verdunning van 12.5 pM. Meng tot een nieuwe koker, het zwembad 10 pM met 20% 12.5 pM Control library.
Opmerking: Bisulfiet Omzetting introduceert zeer lage complexiteit. 20% controle bibliotheek spike-in zal leiden tot betere rangschikken. - Voer een 150 bp gekoppeld-einde sequencing met behulp van een diepe sequencing-instrument.
7. computationele analyse - schatting Methylation niveaus
- Genereren .fastq bestanden (hier sample1_R1.fastq.gz en sample1_R2.fastq.gz genoemd), het genereren van een index Bismark (Altmark) van het volledige genoom van belang (hier in een map met de naam bismarkIndex) en ervoor te zorgen dat de genomic volgorde van chrM beschikbaar in fasta is formaat (hier in een map met de naam chrM).
- Vooraf verwerken leest Schakel adapters en bias geïntroduceerd door de inleidingen: gebruik het hulpprogramma Trim_galore33. Verwijder twee nucleotiden aan het einde 5' van de voorwaartse en omgekeerde luidt.
trim_galore--clip_R1 2--clip_R2 2 -o. /--trim1--gekoppeld sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - Uitlijnen van voorbewerkte leest aan het hele genoom van Bismark (Altmark)34
Bismark (Altmark)--Zwaluwstaart--bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz
Opmerking: Als een ander aligner wordt gebruikt, zorg ervoor dat leest die uniek kunnen niet worden uitgelijnd worden genegeerd. - Uittreksel leest toewijzing aan het chromosoom M, hier met behulp van Samtools35
samtools sorteren -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM
samtools index sample1_sorted.bam
samtools bekijken -u sample1_sorted.bam chrM | samtools sorteren - n - O BAM -o sample1_chrM.bam - Haal de methylering informatie
bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--uitgebreide--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam - De .bedGraph, de cov of de CX_report.txt-bestanden gebruiken voor verdere analyse. Het sample1_chrM.CX_report.txt-bestand gebruikt voor visualisatie en testen.
- Uitvoeren verder knippen in de pre-processing stap, als meerdere regio's zijn ondervraagd en een primer vertekening zichtbaar in de percelen van de M-bias gegenereerd tijdens de toewijzing kan worden Raadpleeg de documentatie van de Bismark (Altmark) voor meer informatie.
8. rekenkundige analyse - Test van verschillen
- Ervoor zorgen dat het bestand CX_report.txt 7 kolommen, chromosoom (hier chrM), positie, strand, aantal gemethyleerd leest, aantal unmethylated leest, C context en omliggende sequentie, voor elke C op chromosoom M bevat.
- Aangezien de CX_report chrM in zijn geheel dekt, Controleer de subset aan de regio('s) die wordt versterkt.
- Gebruik niet-parametrische tests voor verschillen tussen monsters, zoals een vissers de exacte test voor individuele C's of een teken-voor een hele regio.
Opmerking: Kwantificering vaak worden dicht bij methylation van 0%, dat is de reden waarom het uitgaande van normaliteit niet geschikt is. - Ook voor visualisatie, visualiseren van quantiles of berekenen binomiale aandeel betrouwbaarheidsintervallen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Twee stappen in dit protocol zijn cruciaal bij het onderzoeken van mtDNA methylering. 1) de opening van de secundaire structuur en 2) het ontwerp van mitochondriaal DNA-specifieke primers.
Door het verteren van het menselijke genomic DNA met de restrictie-enzym BamHI (Figuur 1), de mitochondriale DNA-structuur zal worden gesneden op nucleotide positie 14,258 en de secundaire structuur zal worden geopend.
De mogelijke bijzondere waardevermindering van Bisulfiet Omzetting met een intact mtDNA secundaire structuur is het zeer waarschijnlijk te overschatten het mtDNA unconversion tarief. Door bisulfiet sequencing, het mtDNA unconversion tarief werd onderzocht in onverteerde en verteerd totale DNA van menselijke skeletspier cellen, bij 5 verschillende regio's van het mitochondriaal genoom: de verplaatsing lus (D-Loop), tRNA fenylalanine en 12S ribosoom (tRNA - F + 12S), 16S ribosoom (16S), NADH dehydrogenase 5 (ND5) en (CYTB) mRNA-encoding cytochroom b (Figuur 2). Unconversion tarief varieerden van 0 - 15,1% in alle onderzochte regio's voor onverteerd mtDNA. Echter wanneer het DNA werd verteerd voorafgaand aan Bisulfiet Omzetting, het unconversion tarief daalde tot een maximum van 1% over alle regio's (Figuur 3). Dus, illustreren het belang van de BamHI spijsvertering voorafgaand aan bisulfiet omzetting te vermijden overschatting van mtDNA methylering niveaus.
Besmetting van nucleaire DNA is onvermijdelijk, wanneer het mitochondriaal genoom isoleren en omdat bijna de gehele mitochondriaal genoom is gerepliceerd in het nucleair genoom, het aanleiding heeft gegeven tot nucleaire inlassingen uit het mitochondriaal genoom genoemd nucleaire Mitochondriale segmenten (NUMTs)36. Om ervoor te zorgen dat de geanalyseerde DNA methylering niveaus komen met het mitochondriaal DNA en niet NUMTs overeen, is het van belang van de ultraperifere ontwerpen van inleidingen die specifiek voor het mitochondriaal genoom zijn. Figuur 4 laat zien hoe om te controleren de specificiteit van de primer en de tabel 1 geeft menselijke en de muis mtDNA primer sequenties.
| Naam | Volgorde | Positie | Amplicon grootte | Onthardende temperatuur | Strand | ||
| Menselijke | |||||||
| D-Loop | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55° C | Antisense | |||
| D-Loop | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55° C | Antisense | |||
| 12S + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55° C | Antisense | |||
| 16S | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53° C | Zin | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091-15243 | 152 | 55° C | Zin | |||
| Muis | |||||||
| 12S | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53° C | Antisense | |||
| 16S | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53° C | Antisense | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129-14307 | 178 | 55° C | Antisense | |||
| 16S | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55° C | Zin | |||
| ND5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659-12910 | 251 | 55° C | Zin | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242-14504 | 262 | 55° C | Zin | |||
Tabel 1: Primer sequenties voor mens en muis mtDNA. Merk op dat onthardende temperaturen voor PCR inleidingen als gevolg van verschillen in de smelttemperatuur van inleidingen variëren.
Figuur 1 : Gel elektroforese van BamHI-verteerd, of onverteerd DNA. Genomic DNA van menselijke skeletspier was onbehandeld of gedurende 4 uur bij 37° C behandeld met BamHI en gelelektroforese werd gerund op een 1,5% agarose gel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Kaart van de menselijke mitochondriaal genoom. Regio's van het mitochondriaal genoom onderzocht door bisulfiet sequencing en de BamHI restrictie-enzym-site worden weergegeven. Het mitochondriaal DNA bevat 13 mRNAs, 2 ribosomaal RNAs en 22 overdracht RNAs. Afkortingen: PH1: zware fronten promotor 1; PH2: zware fronten bevorderen 2; PL: licht-onderdeel de promotor; OH: Oorsprong van replicatie van zware-strand; OL: oorsprong van replicatie van licht-strand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : BamHI spijsvertering voorafgaand aan Bisulfiet Omzetting vermindert het mtDNA unconversion tarief in de menselijke skeletspier cellen. Door bisulfiet sequencing, onverteerd en verteerd mitochondriaal DNA unconversion percentage werden ondervraagd in vijf verschillende regio's van het mitochondriaal genoom in menselijke skeletspier cellen (N= 3). Het volledige plein CpG sites vertegenwoordigt, en het open plein niet-CpG sites vertegenwoordigt. Resultaten worden gepresenteerd met een min-max-interval en een teken test werd gebruikt om te testen voor aanzienlijke unconversion verschillen. D-Loop (6-298) P= 1.83E-42; D-Loop (279-458): P= 4.55E-13; tRNA - F + 12S: P= 8.38E-16; 16S: P= 5.91E-06; ND5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-Loop (6-298) bevat de oorsprong van replicatie en tRNA - F + 12S zware strand promotor 2. Deze gegevens zijn gepubliceerd elders 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Het gebruik van Bisearch om te controleren of de primer specificiteit naar het mitochondriaal genoom. A) primer bisulfiet-geconverteerde reeksen zijn toegevoegd aan de BiSearch functie Primer Search (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). De bisulfiet is aangevinkt, en een referentie-genoom is geselecteerd. B) voorbeeld van mogelijke PCR producten gegenereerd op de betekenis en antisense ketens. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij bieden hier een bisulfiet-sequencing-protocol die speciaal bedoeld is om te ondervragen mtDNA methylering. De verschillen met bisulfiet-sequencing protocollen die worden gebruikt voor genomic DNA ligt in het gebruik van een voorafgaande restrictie-enzym spijsvertering stap en een analyse van bioinformatic uitspraak uit de valse positieve die voortvloeien uit NUMT sequenties.
Wij bieden een protocol Voorkom bisulfiet-sequencing artefacten bij het onderzoeken van mtDNA methylering. Bisulfiet sequencing artefacten leidt tot vals-positieven waren eerder gemelde37. Onvoldoende verwijdering van DNA accessoire eiwitten door proteïnase die k is beschreven37. Onvolledige denaturatie of gedeeltelijke reannealing kan leiden tot stukken van onvolledige omzetting, eventueel door het verlagen van de toegang van bisulfiet single-stranded DNA37. Het latere artefact zou spelen in mtDNA waar een secundaire structuur zou schaden toegang tot cytosines. Tot de beste van onze kennis, is de toevoeging van een restrictie-enzym spijsvertering stap voorafgaand aan Bisulfiet Omzetting in het kader van het mtDNA methylering schatten eerst gemeld in 20163,28. In onze handen verlaagd voorafgaande spijsvertering met een single-cutter restrictie-enzym ook dramatisch detectie van onbekeerde cytosines3,28.
Hier bieden we een pijpleiding bioinformatic bisulfiet rangschikkend resultaten te analyseren en te detecteren bisulfiet sequencing artefacten in het kader van geheel mitochondriaal genoom bisulfiet sequencing. Deze methode is afkomstig uit onze waarneming dat mtDNA niet-succespercentage was omgekeerd gecorreleerd met de diepte3,28sequencing. Deze observatie suggereert dat de secundaire en zelfs tertiaire structuur van mtDNA de versnippering van mtDNA op specifieke regio's tijdens de bouw van sequencing bibliotheken schaadt en ook volledige toegang van natrium bisulfiet aan mtDNA zou kunnen schaden. Omdat de spijsvertering met een één-cutter enzym releases secundaire en tertiaire structuren, blijkt onze resultaten dat mtDNA structuur is een bron van bisulfiet artefact en valideren van de methodes die hierin worden beschreven voor de kwantificering van cytosine methylering in mtDNA.
De onvermijdelijke verontreiniging van nucleaire DNA in mitochondriale voorbereiding vormt een uitdaging. Dit leidt tot verontreiniging in NUMT sequenties in volgorde leest, die kan vertekening schatting van cytosine methylering in mtDNA, zelfs wanneer het uitvoeren van gerichte en niet hele mitochondriaal genoom bisulfiet sequencing. Om te voorkomen dat een dergelijke bias, kunt het ontwerpen van unieke bisulfiet sequencing inleidingen uitsluiten van besmetting met Methyleren aan NUMTs. NUMTs omvatten bepaalde regio's van de mens en de muis mitochondriaal genoom met 100% identiteit, en het is daarom onmogelijk uniek inleidingen op bepaalde gebieden mtDNA ontwerpen. Bij het uitvoeren van hele mitochondriaal genoom bisulfiet sequencing, sequencing lang kunnen leest verlichten discriminatie tussen mtDNA en NUMTs. Uitlijnen leest de hele genoom en gebruik alleen leest uniek toegewezen aan het mitochondriaal genoom kunnen verder te zorgen voor opsporing van mtDNA methylering.
Tenslotte kan dit protocol worden gebruikt buiten mitochondriaal genoom, bijvoorbeeld, in andere gevallen van bisulfiet sequencing waar de secundaire structuur van DNA een potentiële bron van artefact vormt. De associatie tussen methylering niveaus en sequencing diepte kan worden onderzocht om te kunnen beoordelen van de noodzaak van een spijsvertering met een restrictie-enzym vóór bisulfiet sequentiebepaling van complexe opeenvolgingen van DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te verklaren.
Acknowledgments
De Novo Nordisk Stichting Centrum voor metabole basisonderzoek is een onafhankelijke onderzoekscentrum aan de Universiteit van Kopenhagen gedeeltelijk gefinancierd door een onbeperkte donatie van de Novo Nordisk Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E.
- Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
