Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie
Summary
Hier presenteren we een protocol zodat nauwkeurige kwantificering van mitochondriale methylation van DNA (mtDNA). In dit protocol beschrijven we een enzymatische spijsvertering van DNA met BamHI in combinatie met een bioinformatic analyse pijpleiding die kan worden gebruikt om te voorkomen dat overschatting van mtDNA methylering niveaus veroorzaakt door de secundaire structuur van mtDNA.
Abstract
Kwantificering van methylation van DNA kan worden bereikt met behulp van bisulfiet sequencing, die profiteert van de eigenschap van natrium bisulfiet unmethylated cytosine omzetten in uracil, in een context van single-stranded DNA. Bisulfiet sequencing kan worden gericht (met behulp van PCR) of uitgevoerd op het hele genoom en biedt absolute kwantificering van cytosine Methyleren aan de enkele base-resolutie. Gezien de verschillende aard van nucleaire- en mitochondriaal DNA, met name in de secundaire structuur, moeten aanpassingen van bisulfiet sequencing methoden voor onderzoek van cytosine methylering in mtDNA worden gemaakt. Secundaire en tertiaire structuur van mtDNA kan inderdaad leiden tot bisulfiet artefacten leidt tot vals-positieven te wijten aan de slechte toegang onvolledig denaturatie van bisulfiet naar single-stranded DNA sequencing. Hier beschrijven we een protocol met behulp van een enzymatische spijsvertering van DNA met BamHI in combinatie met bioinformatic analyse pijpleiding om nauwkeurige kwantificering van cytosine methylering niveaus in mtDNA. Bovendien, wij bieden richtlijnen voor het ontwerpen van het Bisulfiet sequencing primers specifiek voor mtDNA, (NUMTs) ingevoegd om te voorkomen dat ongewenste nucleaire mitochondriale segmenten richten het nucleair genoom.
Introduction
Het mitochondriaal genoom is een circulaire, double-stranded structuur van ongeveer 16,5-kilo base (kb) lang, die deel uitmaken van een zware en een lichte onderdeel. Het mitochondriaal genoom is aanwezig in meerdere exemplaren binnen elke cel, maternally-geërfd, en codeert van essentiële componenten van de respiratoire keten complexen1. Gelijkaardig aan bacteriële genoom en in tegenstelling tot het nucleair genoom, het mitochondriaal genoom is georganiseerd in talrijke secundaire en tertiaire structuren, zoals in opgerolde en supercoiled structuren2, die toegang tijdens sequencing bemoeilijken kan experimenten-3.
In de kern is methylation van DNA een uitgebreid bestudeerde epigenetische teken dat een rol in tal van processen, met name in de regulatie van genexpressie speelt. Methylation van DNA doet zich voor in zoogdieren genomen, hoofdzakelijk op de 5-positie van de pyrimidine-ring van deoxycytidines, meestal op CG dinucleotides (of APR). Cytosine methylering komt voor bij 70% van alle apr in het genoom van somatische cellen en ~ 1% van het totaal dat DNA bases4. DNA-methyleringen is ook beschreven in niet-CpG contexten, zoals CpC, CpA en CpT en bestaan in verschillende hoeveelheden in nucleaire DNA, met waarden van maximaal 25% van alle methylated cytosines in embryonale stamcellen5,6,7.
Terwijl cytosine methylering van het nucleair genoom is geaccepteerd, is het bestaan van mitochondriale methylation van DNA (mtDNA) nog steeds controversieel. De eerste studie behandelende mtDNA methylering werd uitgevoerd in gekweekte cellen waar mtDNA methylering gemakkelijk waargenomen is, hoewel op een lager niveau in vergelijking met nucleaire DNA8. In zowel menselijke als lymfkliertest cellen, werd mtDNA methylering ook ontdekt op een laag niveau (2-5%). Met behulp van tests te vertrouwen op 5 methylcytosine vangen zoals gemethyleerd DNA immunoprecipitation (MeDIP) gevolgd door kwantitatieve PCR, mtDNA methylation is ook aangetroffen in verschillende muis en mens en cellen lijnen9,10, 11,12. Met behulp van antilichamen tegen 5-methylcytosine in een ELISA-test of de massaspectrometrie, werden aanzienlijke niveaus van methylation van DNA ontdekt van gezuiverde mitochondriale breuken13,14,15, 16. de meeste van de tests in de bovengenoemde studies echter gebruikt technieken die niet zijn ontworpen voor een absolute kwantificering van methylation van DNA op de enkele base-resolutie.
Kwantitatieve en ontbindende methylation van DNA analyse kan worden bereikt door een techniek genaamd “bisulfiet sequencing”, die profiteert van de eigenschap van natrium bisulfiet unmethylated cytosine omzetten in uracil in single-stranded DNA context17 . Met bisulfiet sequencing, is een constellatie van studies de aanwezigheid van cytosine Methyleren aan verschillende niveaus geconstateerd. Methylation mtDNA in de D-loop-regio, de 12S of de 16S-regio is gemakkelijk waargenomen in menselijke18,19,20,21,22,23 en muis24 weefsels en cellen, echter met een intrigerende variabiliteit, van 1-20% van de totale cytosines over studies.
In vergelijking met die talrijke studies hebben alleen een paar studies, met inbegrip van onze fractie, betwist de aanwezigheid van mtDNA methylering3,25,26,27 of vraagtekens bij de biologische relevantie van zeer lage niveaus van mtDNA niveaus (onder 2%)28. Onlangs meldden we de waarneming van een potentiële bisulfiet-sequencing artefact in hele mitochondriale bisulfiet sequencing3. We aangetoond dat de secundaire structuur van mitochondriaal DNA kan leiden tot valse positieven in bisulfiet sequencing, waardoor overschatting van methylering niveaus. Wij bieden hier een protocol om te voorkomen dat een artefact van Bisulfiet-Omzetting van mtDNA. Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudige enzymatische spijsvertering van DNA te verstoren mtDNA secondaire structuren en volledige toegang toe tot bisulfiet volgens een bisulfiet sequencing protocol. Daarnaast bieden wij een begeleidende bioinformatic pijpleiding voor de analyse van bisulfiet sequencing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij bieden hier een bisulfiet-sequencing-protocol die speciaal bedoeld is om te ondervragen mtDNA methylering. De verschillen met bisulfiet-sequencing protocollen die worden gebruikt voor genomic DNA ligt in het gebruik van een voorafgaande restrictie-enzym spijsvertering stap en een analyse van bioinformatic uitspraak uit de valse positieve die voortvloeien uit NUMT sequenties.
Wij bieden een protocol Voorkom bisulfiet-sequencing artefacten bij het onderzoeken van mtDNA methylering. Bisulfiet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De Novo Nordisk Stichting Centrum voor metabole basisonderzoek is een onafhankelijke onderzoekscentrum aan de Universiteit van Kopenhagen gedeeltelijk gefinancierd door een onbeperkte donatie van de Novo Nordisk Foundation.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D’Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down’s syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -. M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. . Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. The BiSearch web server. BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
