Tek hücreli Immunophenotype ve sitokin üretimde kitle sitometresi ile periferik tam kan analizi
Summary
Burada bağışıklık fenotipik ve fonksiyonel (hücre içi sitokin indüksiyon) değerlendirmek için bir tek hücreli proteomik yaklaşım tarif değişiklikler periferik tam kan örneklerinde, kitle sitometresi ile analiz.
Abstract
Sitokinler, otoimmün hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, sitokin düzeyleri ölçümü bir girişim self-tolerance ve sonraki otoimmünite dökümü yol açan kesin mekanizmalar anlamak için birden fazla çalışmaların odak noktası olmuştur. Yaklaşımlar şu ana kadar belirli bir yönü (tek veya birkaç hücre tipleri veya sitokinler) bağışıklık sisteminin çalışmaya dayanarak ve karmaşık otoimmün hastalık genel bir değerlendirmesini sağlamaz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz. Sitokin üretim faktörleri, dolaşan “içsel” hasta özel plazma bağlamında birden çok alt bağışıklık hücre kümeleri içinde değerlendirmek için kapsamlı bir tek hücreli yaklaşım burada açıklanmıştır. Bu yaklaşım sağlar hastaya özgü bağışıklık fenotip (yüzey işaretleri) izleme ve fonksiyonu (sitokinler), ya da onun yerli “içsel patojenik” hastalık devlet, veya terapötik ajanlar (içinde VIVO veya ex vivo) huzurunda.
Introduction
Otoimmün hastalıklar morbidite ve mortalite nüfusun % 3-8 etkileyen önemli bir nedenidir. Amerika Birleşik Devletleri’nde önde gelen genç ve orta yaşlı kadınlarda ölüm nedenleri otoimmün hastalıklar arasındadır (Yaş < 65 yaş)1,2. Otoimmün hastalıklar türdeş olmayan klinik sunum ve çeşitli temel immünolojik süreçleri ile karakterizedir. Heterojenite yelpazesi de romatoid artrit (RA) eklem tutulumu ve nörolojik hastalığı multipl skleroz (MS) gibi farklı bozuklukları arasında temsil edilir. Ancak, bu düzeyde heterojen da sistemik lupus eritematozus (SLE) gibi tek bir bozukluğu içinde örneklenir: Diğer hematolojik veya eklem tutulumu3acı çekerken bazı hastalar böbrek patolojisi ile takdim edebilir miyim.
Otoimmün hastalıklar temel immunopathogenesis auto – ve hiper-harekete geçirmek-in birden fazla doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri ve eşlik eden dysregulated sitokin üretim ile ilgili klinik heterojenite yansıtır. Sitokinler otoimmün hastalık patogenezinde önemli rol oynarken, hastalığın mekanizması içindeki belirli rolü anlamak zor olduğu ispatlanmıştır. Sitokinler tarafından Pleiotropi ile karakterize (bir sitokin farklı hücre tipleri üzerinde birden fazla etkileri olabilir), (birden çok sitokinler aynı etkisi olabilir) artıklık, ikilik (bir sitokin pro veya anti inflammatory etkileri farklı koşullar altında olabilir), ve plastisite (sitokinler kalıp içine bir rol farklı ortama bağlı “orijinal” onun bir)4,5,6. Sonuç olarak, nüfus düzeyinde yöntemleri aynı “sitokin ortamın” türdeş olmayan hücresel yanıt ayırt edemez. Benzer şekilde, çalışma (bir tek hücre türü veya sitokin) bağışıklık sisteminin bir belirli konu üzerinde odaklanmak tasarımları, karmaşık otoimmün hastalığı dahil tüm öğeleri genel bir değerlendirmesini sunuyor musunuz. Hasta sera tabanlı çalışmalar otoimmünite önemli anlayışlar tanınan süre tespit dysregulated sitokinler belirli hücresel kaynak sağlamaz.
Son zamanlarda, aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli “patojenik” periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak için bir tek hücreli proteomik yaklaşım geliştirdik. Burada açıklanan iş akışı bozulmamış çevre tam kan örnekleri, izole periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) karşı kullanımı ile karakterizedir. Bütün kan periferik sistemik immün aracılı hastalığı otoimmün hastalığı (yani, nötrofiller, trombosit) ve 2) plazma kez dahil 1) Sigara-mononükleer kan hücreleri de dahil olmak üzere, eğitim için en fizyolojik ilgili araç temsil eder. Nükleik asitler, immün kompleksler ve sitokinler, gibi faktörler dolaşan olan bağışıklık aktive rollere sahip. Yakalamak için “içsel patojenik” dysregulated sitokin üretim, periferik kan örnekleri hemen sonra kan alımı (T0, sıfır) ve 6 h, 37 ° c (fizyolojik vücut ısısı) bir protein taşıma ile kuluçka sonra işlenir inhibitörü “içsel” hastalık durumu (Şekil 1) yansıtacak sitokin üretim (birikimi, T6-T0) tespit etmek için herhangi bir eksojen uyarıcı durumu (T6, saat 6 h), yokluğunda. (6 h kuluçka protein taşıma inhibitörü ile 37 ° C’de) üzerinden yansıtmak dysregulated işlemler veya periferik kan örnekleri olan yolları bağışıklık yanıtı hastalığa, ilgili yer işaret altında aktif çalışmaya bir eksojen ile tedavi Nükleik asitler yanıt yansıtacak sitokin üretim algılamak için geçiş ücreti-gibi-reseptör (TLR) agonistler SLE (T6 + R848, zaman 6 1 µg/mL ile R848 s), söz konusu olduğunda gibi hastalık patogenezinde yansıtır koşulu uyarıcı (T0 vs T6 vs T6 karşılaştırma + R848, Şekil 1). Onlar kesin bağışıklık dysregulated işlemler için belirli hasta ilgilendirmeyen olarak kullanılabilir therapeutics ex vivo, etkileri immunomodulatory eğitim için periferik kan örnekleri bir JAK inhibitörü ile ilgili, terapötik değerlendirilir konsantrasyonu (burada, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, süre 5 ile 6 h uM ruxolitinib), “iç” hastalık durumunda ilaç (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Şekil 1) karşılık olarak değişiklikleri algılamak için. JAK inhibitörleri gibi ra otoimmün hastalıkların tedavisinde başarılı olduğu gösterilmiştir çünkü bir JAK önleyici bu çalışma için seçildi
Aynı anda birden çok bağışıklık hücre alt kümeleri, SLE periferik kan örnekleri yukarıda açıklanan dysregulated işlemleri değerlendirmek için hasta ve sağlıklı kontrol yukarıda açıklandığı gibi işlenen ve kitle sitometresi tarafından analiz. 7,8,9spektral konularda örtüşme olmadan kitle sitometresi, olarak da bilinen sitometresi-zaman–uçuş, 40’tan fazla parametreleri tek hücre analizi sunmaktadır. Bu tekniği nadir toprak metal izotoplar çözünür metal iyonları şeklinde Etiketler antikorlar, fluorophores10yerine bağlı olarak kullanır. Kitle sitometresi teknolojik platform (Yani, ayar ve kalibrasyon, örnek alma) ile ilgili ek ayrıntılar bulunabilir Leipold vd ve McCarthy vd. 11 , 12 yüksek-boyutluluk kitle sitometresi, tek hücreli taneciklik (Malzemeler tablo) ile aynı anda birden fazla sitokinler doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık hücre alt kümeleri boyunca ölçümü sağlar.
Geçerli geleneksel klinik ve laboratuvar parametreleri hassas veya devam eden hastalık aktivitesi veya belirli immunomodulators13daha iyi temel bağışıklık betimlemek gerek yansıtan, cevaben algılamak için belirli genellikle değildir flare-up sürücü değişiklikleri. Sitokin bozukluk kapitalistleri otoimmün hastalığı göz önüne alındığında, antikorlar veya sitokinler hedefleme veya sinyal proteinleri sitokin üretiminin yönetmelikte yer alan küçük moleküler inhibitörleri kullanın tedavi yaklaşımları bir bolluk var Son zamanlarda ortaya çıkan. Temel biçimiyle, burada açıklanan periferik kan analitik yaklaşım hastaya özgü dysregulated hücre alt kümeleri ve anormal sitokin üretim sistemik bulgular ile otoimmün hastalık tanımlamak için bir platform sağlar. Bu metodoloji tedavi seçenekleri kişiselleştirme için belirli dysregulated sitokinler belirlenebilir ve spesifik tedavi seçenekleri olabilir onların yetenek-e doğru immunomodulate değerlendirmek için ex vivo hasta belirli hastalık test sağlar işlem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada biz bir roman, tek hücreli, proteomik yaklaşım aynı anda birden çok bağışıklık hücre tipleri değerlendirmek ve onların çeşitli sitokin tedirginlikler hasta belirli “patojenik” periferik kan plazması dolaşımdaki faktörler ortamda algılamak açıklar. Bu yöntemi periferik tam kan analitik araç ve toplu sitometresi bağışıklık hücresel fenotipik ve fonksiyonel anormallikler değerlendirilmesi için araç olarak kullanır. Yöntem insan ve fare çalışmaları21‘ e ko…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aimee Pugh-Bernard onun fikri girdi ve yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Boettcher Vakfı Webb Waring Biyomedikal Araştırma Ödülü ve Ödülü K23-1K23AR070897 arasında sayı NIH Elena W.Y. Hsieh tarafından desteklenmiştir. O da ödül sayısı çocuk sağlığı ve insan gelişimi ve Lucile Packard Vakfı tarafından K12-HD000850 Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı, Stanford CTSA UL1 TR001085 ve çocuk sağlığı araştırma için destekli yapıldı. Enstitüsü Stanford Üniversitesi.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -. L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -. M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A. Systemic lupus erythematosus. The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).
- O’Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O’Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -. A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
