Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie
Summary
Andremo a discutere una serie di protocolli per l’induzione e la convalida della senescenza cellulare in cellule coltivate. Ci concentriamo sui diversi stimoli che inducono la senescenza e descrivere la quantificazione degli indicatori comuni di senescenza-collegata. Forniamo dettagli tecnici usando i fibroblasti come un modello, ma i protocolli possono essere adattati a vari modelli di cellulari.
Abstract
La senescenza cellulare è uno stato di arresto del ciclo cellulare permanente attivato in risposta a diversi stimoli dannosi. Attivazione della senescenza cellulare è un marchio di garanzia di varie condizioni fisiopatologiche, tra cui la soppressione del tumore, tessuto che ritocca e invecchiamento. Gli induttori di senescenza cellulare in vivo sono ancora poco caratterizzati. Tuttavia, un numero di stimoli utilizzabile per promuovere la senescenza cellulare ex vivo. Fra loro, senescenza-induttori più comuni sono esaurimento replicativa, radiazioni ionizzanti e radiazioni non ionizzanti, farmaci genotossici, stress ossidativo e di demethylating e acetilante agenti. Qui, vi forniremo istruzioni dettagliate su come utilizzare questi stimoli per indurre i fibroblasti nella senescenza. Questo protocollo può essere facilmente adattato per diversi tipi di cellule primarie e linee cellulari, comprese le cellule tumorali. Descriviamo anche diversi metodi per la convalida di induzione di senescenza. In particolare, ci concentriamo sulla misurazione dell’attività dell’enzima lisosomiale β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone), il tasso di sintesi di DNA mediante analisi di incorporazione di 5-Etinil-2′-deoxyuridine (EdU), i livelli di espressione del ciclo cellulare inibitori p16 e p21 e l’espressione e la secrezione dei membri del fenotipo secretivo Senescence (SASP). Infine, forniamo risultati di esempio e discutere ulteriori applicazioni di questi protocolli.
Introduction
Nel 1961, Hayflick e Moorhead segnalato che fibroblasti primari nella cultura perdono il loro potenziale proliferativo dopo successivi passaggi1. Questo processo è causato dalla riduzione sequenza dei telomeri dopo ogni divisione cellulare. Quando i telomeri raggiungono una lunghezza criticamente corta, sono riconosciuti dalla risposta di danno del DNA (DDR) che attiva un arresto irreversibile della proliferazione — anche definito come senescenza replicativa. Senescenza replicativa è attualmente uno dei molti stimoli che sono noti per indurre uno stato di arresto permanente del ciclo cellulare che esegue il rendering di cellule insensibili ai mitogeni sia a segnali apoptotici2,3. Il programma di senescenza è normalmente caratterizzato da funzionalità aggiuntive tra cui alta attività lisosomiale, la disfunzione mitocondriale, cambiamenti nucleari, le riorganizzazioni della cromatina, stress del reticolo endoplasmico, danno del DNA e una senescenza-collegata fenotipo secretivo (SASP)3,4. Le cellule senescenti hanno molteplici funzioni nel corpo: sviluppo, ferita di soppressione del tumore e guarigione2. Allo stesso modo, essi sono noti per svolgere un ruolo importante nell’invecchiamento e, paradossalmente, in progressione di tumore5. Gli effetti negativi e parzialmente contraddittori, di senescenza sono spesso attribuiti alla SASP6.
Recentemente, è stato indicato che l’eliminazione delle cellule senescenti dai topi conduce alla estensione della durata della vita e alla eliminazione di molti l’invecchiamento caratteristiche7,8,9,10,11, 12. allo stesso modo, le droghe multiple sono state sviluppate per eliminare sia le cellule senescenti (senolytics) o per mirare le SASP13,14. Il potenziale terapeutico di anti-invecchiamento ha recentemente attirato più attenzione al campo.
Lo studio dei meccanismi associati a senescenza cellulare e le proiezioni per gli interventi farmacologici si basano pesantemente su modelli ex vivo , particolarmente sui fibroblasti primari umani. Mentre ci sono alcune caratteristiche comuni attivati da induttori di senescenza diversificata, una grande variabilità nel fenotipo di senescenza è osservata e dipende da vari fattori tra cui cella tipo, stimolo e tempo punto3,15, 16,17. È assolutamente necessario prendere in considerazione l’eterogeneità per studiare e targeting cellule senescenti. Di conseguenza, questo protocollo mira a fornire una serie di metodi utilizzati per indurre senescenza in fibroblasti primari utilizzando diversi trattamenti. Come verrà spiegato, i metodi possono essere facilmente adattati ad altri tipi di cella.
Oltre a senescenza replicativa, descriviamo cinque altri trattamenti che induce senescenza: ionizzante radiazione, radiazione ultravioletta (UV), doxorubicina, stress ossidativo ed i cambiamenti epigenetici (vale a dire la promozione di acetilazione dell’istone o demetilazione del DNA) . Entrambi, radiazioni ionizzanti e UV-radiazione causano danni diretti del DNA e, presso la dose appropriata, trigger senescenza18,19. Doxorubicina causa anche senescenza principalmente attraverso il danno del DNA da intercalanti nel DNA e interrompere la funzione di topoisomerasi II e fermando così il DNA riparazione meccanismi20. L’espressione di geni essenziali per la senescenza è normalmente controllato da acetilazione dell’istone e metilazione del DNA. Di conseguenza, gli inibitori dell’istone deacetilasi (ad es., sodio butirrato e SAHA) e DNA demetilanti (ad es., 5-aza) agenti innescano senescenza in cellule altrimenti normali21,22.
Infine, quattro degli indicatori più comuni associati a cellule senescenti sarà spiegato: attività della senescenza associati-β-galattosidasi (SA-β-gallone), tasso di sintesi del DNA dall’analisi di incorporazione di EdU, sovraespressione di regolatori del ciclo cellulare e p16 inibitori di chinasi ciclina-dipendente e p21 e sovraespressione e secrezione dei membri della SASP.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli spiegati qui sono stati ottimizzati per i fibroblasti primari umani, specialmente cellule BJ e WI-38. I protocolli per la senescenza replicativa, radiazioni ionizzanti e doxorubicina, sono stati applicati con successo ad altri tipi di fibroblasti (HCA2 e IMR90) e in altri tipi cellulari (vale a dire neonatali melanociti e cheratinociti o cardiomiociti derivati iPSC) nel nostro laboratorio. Tuttavia, gli adattamenti per i tipi di cellule supplementari possono essere ottimizzati regolando alcuni dettagli come …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Demaria per discussioni fruttuose e Thijmen van Vliet per la condivisione di dati e protocollo sulla senescenza indotta da UV.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
- Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. , (2016).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
- Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
- Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
- Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
- Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
- Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
- Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
- Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
- Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
- Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Recherche en cancérologie. 72, 2251-2261 (2012).
- Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
- Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
- Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
- Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
- Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
- Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
- Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
- Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).
