Induksjon og validering av mobilnettet Senescence i primære menneskeceller
Summary
Her diskuterer vi en rekke protokoller for induksjon og validering av mobilnettet senescence i kulturperler celler. Vi fokuserer på ulike senescence-inducing stimuli og beskrive kvantifisering av vanlige senescence-assosiert markører. Vi tilbyr tekniske detaljer med fibroblaster som modell, men protokollene kan tilpasses ulike mobilnettet modeller.
Abstract
Mobilnettet senescence er en tilstand av permanente celle syklus arrestasjon aktivert svar på ulike skadelige stimuli. Aktivering av mobilnettet senescence er et kjennetegn på ulike patofysiologiske forhold inkludert svulst undertrykkelse, vev remodeling og aldring. Indusere av mobilnettet senescence i vivo kjennetegnes fortsatt dårlig. En rekke stimuli kan imidlertid brukes til å fremme mobilnettet senescence ex vivo. Blant dem er de vanligste senescence-indusere replicative utmattelse, ioniserende og ikke-ioniserende stråling, gentoksisk narkotika, oksidativt stress, demethylating og acetylerende agenter. Her vil vi gi detaljerte instruksjoner om hvordan du bruker disse stimuli for å indusere fibroblaster til senescence. Denne protokollen kan lett tilpasses for ulike typer primære celler og linjer, inkludert kreftceller. Vi har også beskriver forskjellige metoder for validering av senescence induksjon. Spesielt fokusere vi på å måle aktiviteten til lysosomale enzymet Senescence-assosiert β-galactosidase (SA-β-gal,) frekvensen av DNA-syntese med 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) inkorporering analysen, nivåer av uttrykket av cellen syklus hemmere p16 og p21, og uttrykket og sekresjon av medlemmene av Senescence-Associated sekretoriske fenotypen (SASP). Endelig vi gi eksempel resultater og diskutere videre programmer av disse protokollene.
Introduction
I 1961 rapportert Hayflick og Moorhead at primære fibroblaster i kultur miste sitt proliferativ potensial etter påfølgende avsnitt1. Denne prosessen er forårsaket av den sekvensielle forkortelsen av telomeres etter hver celledeling. Når telomeres når en kritisk kort lengde, gjenkjennes de av DNA-skade svar (DDR) som aktiverer en irreversibel arrest spredning-også definert som replicative senescence. Replicative senescence er en av mange stimuli som er kjent for å indusere en tilstand av permanente celle syklus arrestasjon som gjengir cellene ufølsomt både mitogens og apoptotisk signaler2,3. Senescence programmet er vanligvis preget av tilleggsfunksjoner inkludert høy lysosomale aktivitet, mitokondrie dysfunksjon, kjernefysiske endringer, chromatin rearrangements, endoplasmatiske retikulum stress, DNA skade og en senescence-assosiert sekretoriske fenotypen (SASP)3,4. Senescent celler har flere funksjoner i kroppen: utvikling, sår helbredelse og tumor undertrykkelse2. Like, de er kjent for å spille en viktig rolle i aldring og paradoksalt nok i svulst progresjon5. Negativ, og delvis motstridende, effekten av senescence er ofte knyttet til SASP6.
Nylig ble det vist at eliminering av senescent celler fra mus fører livslengden utvidelse og eliminering av mange av aldring funksjoner7,8,9,10,11, 12. er utviklet flere medikamenter på samme måte, å enten fjerne senescent celler (senolytics) eller å målrette de SASP13,14. Anti-aging terapeutiske potensialet har nylig fått mer oppmerksomhet til feltet.
Studiet av mekanismer knyttet til mobilnettet senescence og visninger for farmakologiske intervensjoner avhengig tungt av ex vivo modeller, spesielt på menneskelig primære fibroblaster. Mens det er noen fellestrekk aktivert ved ulike senescence indusere, er en stor variasjon i senescence fenotypen observert og avhengig av forskjellige faktorer, inkludert celle type, stimulans og tid punkt3,15, 16,17. Det er viktig å vurdere heterogenitet for å studere og målretting senescent celler. Derfor mål denne protokollen å gi en rekke metoder for å indusere senescence i primære fibroblaster ved hjelp av ulike behandlinger. Som det vil bli forklart, kan metodene lett tilpasses andre celletyper.
Bortsett fra replicative senescence, beskriver vi fem andre senescence-inducing behandlinger: ioniserende stråling, ultrafiolett (UV) stråling, doksorubicin, oksidativt stress og epigenetic endringer (nemlig markedsføringen av histone acetylation eller DNA demethylation) . Både ioniserende stråling og UV-stråling direkte DNA skade og på riktig dose, utløse senescence18,19. Doksorubicin fører også til senescence hovedsakelig gjennom DNA skade av intercalating i DNA og forstyrre topoisomerase II funksjon og dermed stoppe DNA reparasjon mekanismer20. Uttrykket av gener som er avgjørende for senescence er vanligvis styrt av histone acetylation og DNA metylering. Som en konsekvens, utløse histone deacetylase hemmere (f.eks, natrium butyrate og SAHA) og DNA demethylating (f.eks 5-aza) agenter senescence i andre normale celler21,22.
Til slutt, fire av de vanligste markørene knyttet til senescent celler vil bli forklart: aktiviteten til den senescence tilknyttet-β-galactosidase (SA-β-gal), rate av DNA-syntese av EdU innlemmelse analysen, overuttrykte celle syklus regulatorer og cyclin-avhengige kinase hemmere p16 og p21, og overuttrykte og sekresjon av medlemmene av SASP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollene forklart her var optimalisert for menneskelig primære fibroblaster, spesielt BJ og WI-38 celler. Protokollene for replicative senescence, ioniserende stråling og doksorubicin, har blitt aktivert for andre typer fibroblaster (HCA2 og IMR90) og i andre celletyper (nemlig neonatal melanocytter og keratinocytter eller iPSC-avledet cardiomyocytes) i vårt laboratorium. Imidlertid kan tilpasninger for flere celletyper optimaliseres ved å justere noen detaljer som antall seeded celler, metoder og kjemikalier som…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av The lab for fruktbart diskusjoner og Thijmen van Vliet for deling av data og protokollen på UV-indusert senescence.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
- Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. , (2016).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
- Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
- Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
- Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
- Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
- Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
- Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
- Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
- Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
- Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Recherche en cancérologie. 72, 2251-2261 (2012).
- Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
- Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
- Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
- Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
- Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
- Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
- Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
- Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).
