पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति अनुरेखण
Summary
यहाँ हम जल्दी पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन और आयल अनुभागिंग और counterstaining के लिए विधि. यह एक आसान और त्वरित प्रक्रिया है कि विकास के दौरान जीन की अभिव्यक्ति पर नजर रखने के लिए भी ऊतक वर्गों, अंगों या प्रसंस्कृत कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है.
Abstract
ई कोलाई LacZ जीन, β-galactosidase, मोटे तौर पर जीन अभिव्यक्ति के लिए एक रिपोर्टर के रूप में प्रयोग किया जाता है और कोशिका वंश अध्ययन में एक अनुरेखक के रूप में. शास्त्रीय histochemical प्रतिक्रिया सब्सट्रेट एक्स के hydrolysis पर आधारित है, घाट और लौह आयनों के साथ संयोजन में लड़की है, जो एक अघुलनशील नीले वेग है कि कल्पना करने के लिए आसान है पैदा करता है । इसलिए, β-galactosidase गतिविधि विकास आय के रूप में ब्याज की जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है । यहाँ हम जल्दी पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन और आयल खोदी और counterstaining के लिए बाद में विधि. इसके अतिरिक्त, पूरे भ्रूण स्पष्ट करने के लिए एक प्रक्रिया को बेहतर एक्स-भ्रूण के गहरे क्षेत्रों में लड़की धुंधला कल्पना प्रदान की जाती है । इस कार्यविधि को निष्पादित करने से सुसंगत परिणाम प्राप्त होते हैं, हालांकि पृष्ठभूमि गतिविधि को कम करने के लिए प्रतिक्रिया शर्तों का अनुकूलन आवश्यक है । परख में सीमाएं भी विचार किया जाना चाहिए, विशेष रूप से पूरे माउंट धुंधला में भ्रूण के आकार के बारे में । हमारा प्रोटोकॉल माउस के विकास के दौरान β-galactosidase डिटेक्शन के लिए एक संवेदनशील और एक विश्वसनीय विधि प्रदान करता है जिसे आगे cryostat वर्गों के साथ-साथ पूरे अंगों पर लागू किया जा सकता है । इस प्रकार, गतिशील जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के विकास में आसानी से पूरे भ्रूण में इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन यह भी सेलुलर स्तर पर विस्तृत अभिव्यक्ति तेल खोदी के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है ।
Introduction
आदेश में विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने के लिए, मार्करों के रूप में रिपोर्टर जीन का उपयोग Drosophila से स्तनधारियों के लिए सर्वोपरि है । ट्रांसजेनिक और नॉकआउट जानवरों को शामिल प्रयोगों में, बैक्टीरियल β-galactosidase जीन (LacZ) ई कोलाई (ई. कोलाई) में से एक है सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) catalyzes के hydrolysis में β-galactosides (जैसे लैक्टोज) को अपनी monosaccharides (ग्लूकोज और गैलेक्टोज)5. इसके सबसे अधिक इस्तेमाल किया सब्सट्रेट एक्स-लड़की है (5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), एक ग्लाइकोसाइड है कि β-hydrolyzed दे वृद्धि करने के लिए 5-galactosidase-4-ब्रोमो-3-क्लोरोफ्लूरोकार्बन और hydroxyindole के द्वारा गैलेक्टोज है । पहले एक डिमर में ऑक्सीकरण हो जाता है कि, जब पोटेशियम फेरी के साथ संयुक्त इस्तेमाल किया-और लोह-साइनाइड, एक विशेषता अघुलनशील पैदा करता है, नीला रंग हाला (चित्रा 1)6.
LacZ जीन तीस साल पहले7,8पर एक रिपोर्टर जीन के रूप में इस्तेमाल किया जाना शुरू कर दिया । आमतौर पर, LacZ खुले पढ़ने के फ्रेम के स्थान पर एक अंतर्जात प्रमोटर के बहाव डाला है, तो यह बैक्टीरियल और कोशिका संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है एक विशेष डालने वाले कोशिकाओं कल्पना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंतर्जात के एक अनुरेखक के रूप में ट्रांसजेनिक जानवरों में विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति पैटर्न9. इस संबंध में, β-galactosidase गतिविधि के दृश्य बड़े पैमाने पर पूरे ऊतकों के लिए एकल कोशिकाओं से विकास और सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने के लिए Drosophila में इस्तेमाल किया गया है. Drosophila आनुवंशिकी स्थिर लाइनों में एक संशोधित पी-तत्व रिपोर्टर जीन LacZ युक्त का निर्माण करने के जीनोम में यादृच्छिक स्थानों पर डाला जाता है की पीढ़ी एहसान । इस प्रकार, जब बढ़ाने के तत्वों के प्रभाव के तहत रखा यह एक ऊतक विशिष्ट तरीके से अपनी अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते हैं, जो पिछले दो दशकों के दौरान10कई जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के व्यवस्थित विश्लेषण की अनुमति दी है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने के लिए LacZ जीन अभिव्यक्ति की निगरानी भी Cre-loxP मध्यस्थता पुनर्संयोजन द्वारा जीन पुनर्संयोजन की घटनाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, और उत्परिवर्ती भ्रूण स्टेम सेल डेरिवेटिव के स्थानीयकरण chimeric विश्लेषण में 11, जो विशिष्ट ऊतकों में LacZ अभिव्यक्ति के नियंत्रण के साथ ही लौकिक की सुविधा । इसके अलावा, पूरे भ्रूण में, β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने विभिंन तीव्रता है कि आसानी से विभिंन विकास चरणों में मनाया जा सकता है जीन अभिव्यक्ति में लौकिक परिवर्तन का विश्लेषण में धुंधला पैटर्न का उत्पादन कर सकते है 8,12.
इस अनुच्छेद में, हम एक के लिए एक्स के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति कल्पना प्रोटोकॉल वर्तमान माउस भ्रूण के प्रारंभिक विकास चरणों में पूरे पर्वत ऊतक में धुंधला लड़की । हम एक अति संवेदनशील और सस्ती तकनीक है कि या तो पूरे माउंट नमूनों में या तेल एंबेडेड ऊतकों या भ्रूण के बाद सेलुलर स्तर पर लेबल कोशिकाओं का सही पता लगाने के पक्ष के रूप में इस histochemical विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि ंयूनतम पृष्ठभूमि के साथ माउस के ऊतकों में धुंधला के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है जब अंय13तरीकों के साथ तुलना में ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ई. कोलाई LacZ जीन व्यापक रूप से अपनी उच्च संवेदनशीलता और पता लगाने में आसानी की वजह से जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के अध्ययन में एक रिपोर्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक एंजाइमी प्र…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Centro Nacional de Investigaciones हृदयों (CNIC) में उनकी तकनीकी सहायता के लिए Histopathological सेवा का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम भी कृपया Mt4-एमएमपीLacZ चूहों प्रदान करने के लिए dr. Motoharu Seiki धन्यवाद, और हमारी परियोजना के समर्थन के लिए और पांडुलिपि के उसे महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ एलिसिया जी अर्रोयो. हम इस लेख को ठीक करने के लिए पीटर Bonney शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । यह काम एक अनुदान के माध्यम से Universidad Europea de मैड्रिड द्वारा समर्थित किया गया था (# 2017UEM01) C.S.C. को संमानित किया
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
