Seguimiento de la expresión génica mediante la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo
Summary
Aquí describimos el protocolo estándar para la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo principios y el método de parafina de seccionamiento y contratinción. Este es un procedimiento fácil y rápido para controlar la expresión génica durante el desarrollo que puede aplicarse también a las secciones de tejido, órganos o células cultivadas.
Abstract
La Escherichia coli LacZ codificación del gene, β-galactosidasa, se utiliza en gran parte como reportera de expresión génica y como trazador en estudios de linaje celular. La reacción histoquímica clásica se basa en la hidrólisis del sustrato X-gal en combinación con los iones férricos y ferrosos, que produce un precipitado insoluble de azul que es fácil de visualizar. Por lo tanto, actividad β-galactosidasa sirve como marcador para el patrón de expresión del gen de interés, medida que avanza el desarrollo. Aquí describimos el protocolo estándar para la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo temprano y el posterior método de parafina de seccionamiento y contratinción. Además, se proporciona un procedimiento para clarificar todo embriones para visualizar mejor coloración en regiones más profundas del embrión de X-gal. Resultados se obtienen mediante la realización de este procedimiento, aunque optimización de condiciones de la reacción es necesaria para minimizar la actividad de fondo. Limitaciones en el análisis se deben también considerar, particularmente con respecto al tamaño del embrión en el Monte toda la coloración. Nuestro protocolo proporciona un sensible y un método confiable para la detección de β-galactosidasa durante el desarrollo del ratón que puede ser aún más aplicado a las secciones de criostato como órganos enteros. Así, los patrones de expresión dinámica gene a lo largo del desarrollo se pueden analizar fácilmente mediante el uso de este protocolo en embriones de todo, pero también expresión detallada a nivel celular puede ser evaluada después de parafina secciones.
Introduction
Para describir los patrones de expresión del gen específico, el uso de genes como marcadores del reportero ha sido primordial de Drosophila a mamíferos. En experimentos con animales transgénicos y knockout, el gen bacteriano de la β-galactosidasa (LacZ) de Escherichia coli (e. coli) es uno de los más utilizados1,2,3, 4. β-galactosidasa (β-gal) cataliza la hidrólisis de β-galactósidos (como la lactosa) en sus monosacáridos (glucosa y galactosa)5. Su sustrato más utilizado es X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), un glucósido que se hidroliza por que dé lugar a 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole y galactosa β-galactosidasa. La primera es oxidada en un dimer que, cuando se utiliza combinado con potasio ferri- y ferro-cianuro, produce un característico insoluble, precipitado de color azul (figura 1)6.
El gene del LacZ comenzó a usarse como un gen reportero hace más de treinta años de7,8. Por lo general, se inserta el LacZ aguas abajo de un promotor endógeno en el lugar del marco de lectura abierto, por lo que puede ser utilizado en la cultura bacteriana y celular para visualizar las células que contienen un relleno especial, así como en animales transgénicos como un trazador de endógeno patrones de expresión génica durante el desarrollo9. En este sentido, la visualización de actividad β-galactosidasa se ha ampliamente utilizada en Drosophila para entender los procesos del desarrollo y celulares de las células a los tejidos todos. Genética de la Drosophila a favor de la generación de líneas estables en los que una construcción de elemento P modificada que contiene el gen reportero que lacZ es insertada al azar localizaciones en el genoma. Así, cuando se coloca bajo la influencia de elementos de reforzador puede conducir su expresión en una forma específica de tejido, que ha permitido el análisis sistemático de los patrones de expresión de muchos genes durante los últimos dos décadas10. Además, el uso de ratones transgénicos para controlar la expresión del gen LacZ también permite la detección de eventos de recombinación génica en Cre-loxP mediada por recombinación y la localización de los derivados de células madre embrionarias mutantes quiméricos análisis 11, que facilita el control de la expresión de LacZ en tejidos específicos, así como temporal. También, en embriones de todo, la detección de la actividad β-galactosidasa puede producir patrones de tinción diferencial en diferentes intensidades que se pueden observar convenientemente a través de diferentes etapas de desarrollo para analizar cambios temporales en la expresión del gen 8,12.
En este artículo, presentamos un protocolo para visualizar la expresión génica a través de X-gal la coloración en el tejido de montar todo en las primeras etapas del desarrollo de embriones de ratón. Presentamos este método histoquímico como una técnica altamente sensible y económica que favorece la detección precisa de las células etiquetadas en especímenes de todo Monte o a nivel celular después de embebido de parafina tejidos o embriones. El método permite la visualización directa de la coloración en el tejido de ratón con el Fondo mínimo en comparación con otros métodos13.
Protocol
Representative Results
Discussion
El gen LacZ de e. coli ha sido ampliamente utilizado como reportero en los estudios de patrones de expresión génica debido a su alta sensibilidad y facilidad de detección. El presente Protocolo describe un método clásico para detectar la expresión de β-gal basada en una reacción enzimática que es fácil y rápido de realizar y barato. Este método también puede aplicarse sin modificaciones importantes en todo montaje embriones, órganos intactos, secciones de criostato del tejido o células cultivadas….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer el servicio histopatológicos para su asistencia técnica en el Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). También agradecemos a Dr. Motoharu Seiki para ratones de Mt4-mmpLacZ que amablemente y el Dr. Alicia G. Arroyo para apoyar nuestro proyecto y para su lectura crítica del manuscrito. Queremos agradecer a Peter Bonney para corregir este artículo. Este trabajo fue financiado por la Universidad Europea de Madrid por medio de una beca (# 2017UEM01) concedida a C.S.C.
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
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