الجمعية السريع، وقابلة للتطوير والتحميل من البروتينات النشطة بيولوجيا، وإيمونوستيمولانتس إلى نانوكاريرس الاصطناعية المتنوعة عبر نانوبريسيبيتيشن فلاش
Summary
توفير المواد النانوية تنوعاً آليات التسليم المراقب العلاجي للعلوم الأساسية والتطبيقات متعدية الجنسيات، ولكن على تلفيق غالباً ما تتطلب خبرة غير متوفر في المختبرات الطبية الأكثر. نقدم هنا، بروتوكولات قابلة التصنيع وتحميل العلاجية المتنوعة نانوكاريرس الذاتي تجميعها باستخدام نانوبريسيبيتيشن فلاش.
Abstract
المواد النانوية يقدم مجموعة واسعة من الخيارات لتخصيص التسليم المراقب من حمولات الجزيئية مفردة ومجتمعة للتطبيقات العلاجية والتصوير. يمكن أن يكون هذا التحديد زيادة آثار سريرية هامة، بما في ذلك انخفاض الآثار الجانبية والجرعات المنخفضة بفاعلية أكبر. وعلاوة على ذلك، في الموقع استهداف والتحوير التي تسيطر عليها من مجموعات فرعية خلية معينة يمكن تعزيز التحقيقات في المختبر و في فيفو الظواهر البيولوجية الأساسية والتحقيق في وظيفة الخلية. ولسوء الحظ، الخبرة المطلوبة في علوم النانو والكيمياء والهندسة وكثيراً ما تحظر المختبرات دون خبرة في هذه المجالات من اختﻻق وتخصيص المواد النانوية كأدوات لتحقيقاتها أو المركبات لما الاستراتيجيات العلاجية. هنا، نحن نقدم البروتوكولات للتوليف والجمعية قابلة نظام كوبوليمر تنوعاً غير سامة كتلة قابلة لتشكيل السطحية وتحميل مركبات النانو للتطبيقات الطبية الحيوية. ويرد نانوبريسيبيتيشن فلاش كمنهجية للتصنيع السريع من نانوكاريرس متنوعة من poly(ethylene glycol)-bl-البوليمرات الإسهامية بولي (كبريتيد البروبيلين). هذه البروتوكولات سيسمح مختبرات مع مجموعة واسعة من الخبرات والموارد اللازمة لسهولة وتكاثر اختﻻق نظم إيصالها nanocarrier متقدمة للتطبيقات الخاصة بهم. عملية تصميم وتشييد صك المؤتمتة التي تستخدم مضخة الحقن عالية السرعة لتسهيل نانوبريسيبيتيشن فلاش والسماح لتعزيز السيطرة على التجانس، الحجم ومورفولوجيا وتحميل نانوكاريرس بوليميرسومي ووصف.
Introduction
نانوكاريرس تسمح بالتسليم المراقب للشحنات الصغيرة والجزيئات، الكيانات النشطة بما في ذلك، هذا أن لم يكن مغلفة، سيكون أما التحلل بدرجة عالية و/أو مسعور جداً للإدارة في فيفو. مورفولوجيس nanocarrier ملفقة بانتظام، حويصلات البوليمرية يناظر الدهنية (وتسمى أيضا بوليميرسوميس) توفر القدرة على تحميل الشحنات ماء ومسعور1،2في وقت واحد. على الرغم من مزاياها واعدة، بوليميرسوميس ما زالت نادرة في التطبيقات السريرية يرجع، جزئيا، إلى العديد من التحديات الرئيسية في صنعها. للاستخدام السريري، يلزم تركيبات بوليميرسومي على دفعات على نطاق واسع والعقيمة، ومتسقة.
يمكن استخدام عدد من التقنيات للنموذج بوليميرسوميس من كوبوليمر ديبلوك، مثل poly(ethylene glycol)-كتلة-بولي (كبريتيد البروبيلين) (شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي)، التي تشمل المذيبات التشتت3، رقيقة الإماهة1 , 4، 5،ميكروفلويديكس6، وترطيب مباشرة7. تشتت المذيبات تنطوي على حضانة طويلة أوقات حضور المذيبات العضوية، التي قد تؤذي بعض الحمولات النشطة بيولوجيا، مثل البروتينات. لا تقدم الإماهة رقيقة السيطرة على بوليديسبيرسيتي بوليميرسوميس المشكلة، وكثيراً ما تتطلب تقنيات البثق مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لتحقيق مونوديسبيرسيتي مقبولة. وعلاوة على ذلك، يصعب ميكروفلويدس وترطيب مباشرة إلى مقياس لحجم الإنتاج الأكبر. أساليب تصنيع nanocarrier المختلفة، يقدم نانوبريسيبيتيشن فلاش (تزعمت) القدرة على جعل تركيبات واسعة النطاق واستنساخه8،،من910. بينما تزعمت تم حجزها من قبل لصياغة جسيمات نانوية النواة الصلبة، لدينا مختبر وسعت مؤخرا استخدام تزعمت تشمل تشكيل متسقة المتنوعة شماعة-bl-ذكر المكتب الصحفي نانوستروكتوري مورفولوجيس11، 12، بما في ذلك بوليميرسوميس11 وبيكونتينووس نانوسفيريس12. وجدنا أن تزعمت كان قادراً على تشكيل تركيبات مونوديسبيرسي من بوليميرسوميس دون الحاجة لقذف، أسفر عن قيم الفهرس polydispersity متفوقة مقارنة مع بوليميرسوميس غير مقذوف شكلتها تشتت الإماهة والمذيبات رقيقة 11-نانوسفيريس بيكونتينووس، مع نطاقاتها مسعور كبيرة، لم تكن قادرة على أن تتشكل بواسطة الإماهة رقيقة، وعلى الرغم من تشكيل تحت عدد من الشروط المذيبات مع تزعمت12.
هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للتقرير التوليفي الوتد-bl-PPS ديبلوك كوبوليمر المستخدمة في تشكيل بوليميرسومي، خلاط الطائرات (CIJ) اصطدام يقتصر استخدامها للأغذية، تزعمت البروتوكول نفسه، وتنفيذ النظام الآلي الحد من تقلب المستخدم. وشملت هو المعلومات المتعلقة بكيفية تعقيم النظام بما فيه الكفاية لإنتاج مستحضرات خالية من الذيفان للاستخدام في فيفو، وممثله من البيانات المتعلقة بتوصيف بوليميرسوميس التي تزعمت شكلها. مع هذه المعلومات، سيكون قادراً على اختﻻق بهم تركيبات مونوديسبيرسي العقيمة، مع الاهتمام باستخدام بوليميرسوميس للعمل في المختبر و في فيفو القراء. القراء مع خبرة في تركيبات nanocarrier ومع الخبرة توليف البوليمر سوف تكون قادرة على اختبار سرعة نظمها البوليمر استخدام تزعمت كبديل محتمل لتقنيات الصياغة الحالية. بالإضافة إلى ذلك، قد تستخدم البروتوكولات المبينة في هذا التقرير كأدوات تعليمية لصياغة نانوكاريرس في دورات مختبر تكنولوجيا النانو.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقدمنا الإرشادات التفصيلية لتلفيق السريع من بوليميرسوميس استخدام شماعة17–bl-PPS35-ش كوبوليمر ديبلوك. بوليميرسوميس حويصلية هي مورفولوجية الإجمالية الأولية المجتمعون في هذه النسبة شماعة ماء والوزن الجزيئي كتلة الصحفي مسعور. عندما تمس عدة مرات، لديهم قطره و polydispersity يطابق بولي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بالموظفين والأجهزة الدعم من “مرفق الأحياء الهيكلية” في جامعة نورث وسترن. من المسلم به الدعم من الصحة الإنجابية لوري شاملة سرطان مركز من جامعة “نورث ويسترن” ومرافق الجامعة الهيكلية علم الأحياء الشمالية الغربية. كاشف الإلكترون مباشرة K2 غاتان تم شراؤها بأموال مقدمة من “اتحاد الطب الحيوي في شيكاغو” بدعم من “أموال سيرل” في “ثقة المجتمع شيكاغو”. ونشكر أيضا المرافق التالية في جامعة نورث وسترن: كيك متعدد التخصصات سطح العلم المرفق ومرفق الأحياء الهيكلية، مرفق التصوير البيولوجي، مركز “متقدم التصوير الجزيئي”، والتحليلي بيونانوتيتشنولوجي المعدات الأساسية. وأيد هذا البحث منح “المؤسسة الوطنية للعلوم” 1453576، المعاهد الوطنية للصحة المدير “الجديد المبتكر جائزة” 1DP2HL132390-01، مركز التجدد لطب النانوي محفز وجائزة 2014 ماكورميك محفز. وأيد حزب العمل الديمقراطي في الجزء التدريب التكنولوجيا الأحيائية بريدوكتورال المعاهد الوطنية للصحة منحة T32GM008449.
Materials
| CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit – 32 GB Edition | CanaKit | UPC 682710991511 | |
| Linear Bearing Platform (Small) – 8mm Diameter | Adafruit | 1179 | |
| Linear Motion 8 mm Shaft, 330 mm Length, Chrome Plated, Case Hardened, Metric | VXB | kit11868 | |
| Linear Rail Shaft Guide/Support – 8 mm Diameter | Adafruit | 1182 | |
| Manual-Position Precision Slide 4.5" Stroke, 15 lb load capacity | McMaster-Carr | 5236A16 | |
| MTPM-P10-1JK43 Iron Horse DC motor | Iron Horse | MTPM-P10-1JK43 | |
| Official Raspberry Pi Foundation 7" Touchscreen LCD Display | Raspberry Pi | B0153R2A9I (ASIN) | |
| PicoBorg Reverse – Advanced motor control for Raspberry Pi | PiBorg | BURN-0011 | |
| Pololu Carrier with Sharp GP2Y0D810Z0F Digital Distance Sensor 10cm | Pololu | 1134 | |
| Ruland PSR16-5-4-A Set Screw Beam Coupling, Polished Aluminum, Inch, 5/16" Bore A Diameter, 1/4" Bore B Diameter, 1" OD, 1-1/4" Length, 44 lb-in Nominal Torque | Ruland | PSR16-5-4-A | |
| Polyethylene glycol monomethyl ether | Sigma Aldrich | 202495 | |
| Methanesulfonyl chloride | Sigma Aldrich | 471259 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 179418 | |
| Toluene, Anhydrous | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | T0886 | |
| Celite 545 (Diatomaceous Earth) | Sigma Aldrich | 419931 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 320269 | |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | |
| N,N-Dimethylformamide, anhydrous | Sigma Aldrich | 227056 | |
| Potassium carbonate | Sigma Aldrich | 791776 | |
| Thioacetic acid | Sigma Aldrich | T30805 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 360589 | |
| Aluminum oxide, neutral, activated, Brockmann I | Sigma Aldrich | 199974 | |
| Sodium methoxide solution, 0.5 M in methanol | Sigma Aldrich | 403067 | |
| Propylene sulfide | Sigma Aldrich | P53209 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 320390 | |
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma Aldrich | S2770 | |
| Endotoxin-free water | GE Healthcare Life Sciences | SH30529.01 | |
| Paper pH strips | Fisher Scientific | 13-640-508 | |
| Endotoxin-free Dulbecco's PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| Borosilicate glass scintillation vials | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| 1 mL all-plastic syringe | Thermo Scientific | S75101 | |
| Sepharose CL-6B | Sigma Aldrich | CL6B200 | |
| Liquid chromatography column | Sigma Aldrich | C4169 | |
| CIJ mixer, HDPE | Custom | ||
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma Aldrich | 216763 | |
| HEK-Blue hTLR4 | InvivoGen | hkb-htlr4 | |
| RAW-Blue Cells | InvivoGen | raw-sp | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| PYROGENT Gel Clot LAL Assays | Lonza | N183-125 |
References
- Stano, A., Scott, E. A., Dane, K. Y., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Tunable T cell immunity towards a protein antigen using polymersomes vs. solid-core nanoparticles. Biomaterials. 34 (17), 4339-4346 (2013).
- Discher, B. M., et al. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
- Vasdekis, A. E., Scott, E. A., O’Neil, C. P., Psaltis, D., Hubbell, J. A. Precision intracellular delivery based on optofluidic polymersome rupture. ACS Nano. 6 (9), 7850-7857 (2012).
- Yi, S., et al. Tailoring Nanostructure Morphology for Enhanced Targeting of Dendritic Cells in Atherosclerosis. ACS Nano. 10 (12), 11290-11303 (2016).
- Shum, H. C., Kim, J. W., Weitz, D. A. Microfluidic fabrication of monodisperse biocompatible and biodegradable polymersomes with controlled permeability. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9543-9549 (2008).
- Pessi, J., et al. Microfluidics-assisted engineering of polymeric microcapsules with high encapsulation efficiency for protein drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 472 (1-2), 82-87 (2014).
- O’Neil, C. P., Suzuki, T., Demurtas, D., Finka, A., Hubbell, J. A. A novel method for the encapsulation of biomolecules into polymersomes via direct hydration. Langmuir. 25 (16), 9025-9029 (2009).
- Saad, W. S., Prud’homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
- Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302 (2003).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
- Allen, S., Osorio, O., Liu, Y. G., Scott, E. Facile assembly and loading of theranostic polymersomes via multi-impingement flash nanoprecipitation. Journal of Controlled Release. 262, 91-103 (2017).
- Bobbala, S., Allen, S. D., Scott, E. A. Flash nanoprecipitation permits versatile assembly and loading of polymeric bicontinuous cubic nanospheres. Nanoscale. 10 (11), 5078-5088 (2018).
- Allen, S. D., et al. Polymersomes scalably fabricated via flash nanoprecipitation are non-toxic in non-human primates and associate with leukocytes in the spleen and kidney following intravenous administration. Nano Research. , (2018).
- Karabin, N. B., et al. Sustained micellar delivery via inducible transitions in nanostructure morphology. Nature Communications. 9 (1), 624 (2018).
- Mascoli, C. C., Weary, M. E. Limulus amebocyte lysate (LAL) test for detecting pyrogens in parenteral injectable products and medical devices: advantages to manufacturers and regulatory officials. Journal of the Parenteral Drug Association. 33 (2), 81-95 (1979).
- Pustulka, K. M., et al. Flash nanoprecipitation: particle structure and stability. Molecular Pharmaceutics. 10 (11), 4367-4377 (2013).
- Tang, C., Amin, D., Messersmith, P. B., Anthony, J. E., Prud’homme, R. K. Polymer directed self-assembly of pH-responsive antioxidant nanoparticles. Langmuir. 31 (12), 3612-3620 (2015).
- Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud’homme, R. K. Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures. Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).
