10-11 転流 2 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼの LC MS/MS による分析法の開発や効率的に精製
Summary
ここで、紹介タグの付いていない人間の活動の効率的な単一ステップ浄化のためのプロトコル 10 11 転流 2 (TET2) イオン交換クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィー-タンデム質量を使用しての試金を使用して 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼ分析 (クロマトグラフィー-タンデム質量)-ベースのアプローチ。
Abstract
5-メチルシトシン (5mC) を介したエピジェネティックな発現制御は、真核生物の開発で重要な役割を果たしてきました。10-11 転流 dioxygenases (TET1-3)、チミン DNA グリコシラーゼ依存塩基除去修復に続いて連続酸化これらのエピゲノムの脱メチル化を実現します。TET2 遺伝子遺伝子の突然変異によりまたは他のエピジェネティックなメカニズムの不活化は多様な癌、特に造血器腫瘍患者の予後に関連付けられます。ここでは、酵素によって実行中の陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたタグなしの人間型 TET2 ジオキシゲナーゼの効率的な単一ステップ浄化について述べる。さらに別のおよび 4 つの変更されたシトシン塩基 (5-メチル 5-ヒドロキシメチル、5-ホルミルと 5 カルボキシル基) だけでなく、通常の 4 つの DNA 塩基 (A、T、G および C) を定量化できる液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法 (MS/LCMS) アプローチをいたします。この試金は、野生型と変異型 TET2 dioxygenases の活性を評価する使用できます。
Introduction
CpG のジヌクレオチドのシトシン塩基の C5 の位置は、哺乳類のゲノムの1で優勢なメチル化サイト (5mCpG) です。さらに、多くの最近の研究は広範な C5 シトシンのメチル化 (5mC) 非 CpG サイトを発見した (5mCpH、ところ H = A、T、または C)2,3。5mC 変更は、内在性レトロトランスポゾン遺伝子プロモーター3,4,5で転写サイレンサーとして機能します。5mC のメチル化は、X 染色体不活性化、遺伝子刷り込みや核リプログラミング ティッシュ特定の遺伝子表現5,6,7で重要な役割を果たしています。C5 の位置にシトシンのメチル化は、DNA メチル化酵素により行われ、これらの酵素の突然変異を引き起こす重要な発達の欠陥8。5mC マークの除去は、TET1 3 5mC オキシダーゼ9,10によって開始されます。これらのテト家族 dioxygenases 連続酸化ステップ11,12,13によって 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxylcytosine (5caC) 5mC に変換します。最後に、チミン DNA グリコシラーゼは 5 fC または未変更のシトシン塩基除去修復経路11を使用する 5caC を置き換えます。
人間型 TET2遺伝子は骨髄異形成症候群 (MDS)14,15,16、MDS 骨髄増殖性腫瘍 (を含む多様な造血器腫瘍における頻繁変異遺伝子として同定されました。MDS-MPN)、およびデータシートとデータシート MPN16由来急性骨髄性白血病 (AML)。5hmC 骨髄 DNA 修飾のレベルは TET2 の突然変異で野生型 (wt) と比較した患者の下に-TET214。グループの数は、その正常造血と骨髄性変換17,18,19,20における役割を明らかにする TET2 ノックアウト マウス モデルを開発しています。TET2 遺伝子に変異を持つマウスが最初通常で実行可能な明らかに多様な造血器腫瘍、高齢、早期死亡の原因が。これらの研究は、正常な造血分化に wt 型 TET2 演じる重要な役割を示した。これらマウス モデル、(TET2± HSCs) ヘテロ接合体の造血幹細胞およびホモ型 TET2-/-の HSCs が両方 TET2+/-として造血系統の再作成でホモ wt TET2 HSCs 上の優位性TET2-/- HSCs は多様な造血器腫瘍17,18を開発しました。これらの研究は、そのハプロ TET2 ジオキシゲナーゼ HSCs の開発を変更し、造血器腫瘍における結果を示しています。
TET2 遺伝子の変異を持つマウスと同様に、ほとんどの白血病患者マニフェスト型 TET2 ジオキシゲナーゼ活性のハプロ。これらの主にヘテロ接合体の体細胞突然変異は、ナンセンス、フレーム シフト突然変異のほとんどがミスセンス突然変異型 TET2 遺伝子体全体に分散ジオキシゲナーゼ ドメイン12でクラスター化します。日には、少し評価 wt と変異 TET2 は TET2 ジオキシゲナーゼとその分析21の生産の難しさによる主に文学で報告されます。ここで、単純なシングル ステップ精製イオン交換クロマトグラフィーを用いたネイティブ型 TET2 ジオキシゲナーゼを報告します。さらに、定量的なクロマトグラフィー-タンデム質量分析は最適化され、ネイティブ型 TET2 ジオキシゲナーゼの酵素活性を測定するために使用されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
TET2 遺伝子の変異は、多様な造血器悪性腫瘍患者で最も頻繁に検出された遺伝子の変化の一部です。異なる型 TET2 の変異があり、ナンセンス、フレーム シフト、ミスセンス変異が含まれ、数百日に患者12で識別されています。TET2遺伝子変異を有する患者は、wt 型 TET214とのそれらと比較して骨髄でゲノム 5hmC の低レベルを示します。変異型 TET2?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
米国国防総省のアイデア賞を受賞 (W81XWH-13-1-0174)、再生不良性貧血と MDS の基盤助成金の形で資金が供給されたこの研究と UMRB MM の作者に許可感謝モヒト Jaiswal し Subhradeep バール pDEST14 ベクトル型 TET2 の初期クローニングのため。
Materials
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
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