Hier presenteren we een protocol voor een efficiënte Macrostap zuivering van de actieve niet-gelabelde mens tien-elf translocatie-2 (TET2) 5-methylcytosine-dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie- en haar kwantitatieve analyse met behulp van een vloeibare chromatografie-tandem-massa spectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde aanpak.
De epigenetische transcriptieregulatie gemedieerd door 5-methylcytosine (5mC) heeft een cruciale rol gespeeld in eukaryotische ontwikkeling. Demethylatie van deze epigenetische merken gebeurt door oxidatie van de sequentiële door tien-elf translocatie dioxygenases (TET1-3), gevolgd door de thymine-DNA glycosylase-afhankelijke base excision repair. Inactivering van het TET2 gen als gevolg van de genetische mutaties of door andere Epigenetische mechanismen wordt geassocieerd met een slechte prognose bij patiënten met uiteenlopende kankers, vooral hematopoietische maligniteiten. Hier beschrijven we een efficiënte Macrostap zuivering van enzymatisch actieve niet-gelabelde menselijke TET2 dioxygenase met cation exchange chromatografie. Verder bieden we een benadering van de vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) die kan scheiden en kwantificeren van de vier normale DNA-basen (A, T, G en C), evenals de vier gewijzigde cytosine honken (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl en 5-carboxyl). Deze test kan worden gebruikt om te evalueren van de activiteiten van wild type en mutant TET2 dioxygenases.
De C5-positie van cytosine honken binnen apr dinucleotides is de site (5mCpG) van de overheersende methylering in zoogdieren genomen1. Daarnaast een aantal recente studies hebben blootgelegd uitgebreide C5 cytosine methylering (5mC) in niet-CpG sites (5mCpH, waar H = A, T of C)2,3. 5mC wijziging dient als een transcriptionele demper op endogene retrotransposons en gene initiatiefnemers3,4,5. Methylation van DNA bij 5mC speelt ook een belangrijke rol in de inactivering van het X-chromosoom, gene inprenting, nucleaire herprogrammering en weefsel-specifieke gen expressie5,6,7. Methylering van cytosine op de C5-positie is uitgevoerd door DNA methyltransferases en mutaties in deze enzymen veroorzaken aanzienlijke developmental gebreken8. De verwijdering van 5mC merken worden geïnitieerd door TET1-3 5mC oxidasen9,10. Deze TET-familie dioxygenases converteren 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC) door oxidatie van de opeenvolgende stappen11,12,13. Tot slot vervangt thymine-DNA glycosylase 5fC of 5caC naar ongewijzigde cytosine met behulp van de base excision repair traject11.
Het menselijk TET2 -gen werd geïdentificeerd als een vaak gemuteerde gen in uiteenlopende hematopoietische maligniteiten waaronder myelodysplastic syndromes (MDS)14,15,16, MDS-myeloproliferatieve gezwellen ( MDS-MPN), en acute myeloïde leukemie (AML) afkomstig van MDS en MDS-MPN16. De niveaus van 5hmC wijziging in het beenmerg DNA zijn lager bij patiënten met TET2 mutaties vergeleken met degenen met wild-type (wt)-TET214. Een aantal groepen hebben ontwikkeld TET2-knock-out Muismodellen te verhelderen van haar rol in de normale Haematopoiese en myeloïde transformatie17,18,19,20. Deze muizen met mutaties in het gen TET2 waren aanvankelijk normale en levensvatbaar, maar uiteenlopende hematopoietische maligniteiten gemanifesteerd als ze ouder die hun vroege dood veroorzaakt. Deze studies toonden de belangrijke rollen gespeeld door de wt-TET2 bij normale hematopoietische differentiatie. In deze Muismodellen heterozygoot hematopoietische stamcellen (TET2+/- HSCs) en het homozygoot TET2– / – had HSCs een concurrentievoordeel ten opzichte van homozygoot wt-TET2 HSCs in de hematopoietische lineages repopulatie als beide TET2+/- en TET2– / – HSCs ontwikkeld divers hematopoietische maligniteiten17,18. Deze studies tonen aan dat haploinsufficiency van TET2 dioxygenase de ontwikkeling van HSCs verandert en resulteert in de hematopoietische maligniteiten.
Gelijkaardig aan muizen met mutaties in het gen TET2, meeste leukemie-patiënten manifesteren haploinsufficiency van TET2 dioxygenase activiteit. Deze meestal heterozygoot somatische mutaties omvatten frame-shift en nonsense mutaties verspreid over het TET2 gen lichaam terwijl missense mutaties die het meeste geclusterd in het dioxygenase domein12. Tot op heden wordt weinig karakterisering van de wt – en mutant-TET2 gemeld in de literatuur voornamelijk te wijten aan problemen met de productie van TET2 dioxygenase en haar assay-21. Wij rapporteren hier een eenvoudige stap voor stap zuivering van de inheemse TET2 dioxygenase met behulp van ionenwisselingschromatografie. Een kwantitatieve bepaling van de LC-MS/MS was verder geoptimaliseerd en gebruikt voor het meten van de enzymatische activiteit van inheemse TET2 dioxygenase.
Mutaties in TET2 gen zijn enkele van de meest frequent aangetroffen genetische veranderingen bij patiënten met uiteenlopende hematopoietische maligniteiten. Tot nu toe honderden van verschillende TET2 mutaties, waaronder onzin, frame-shift en missense mutaties, zijn geïdentificeerd in patiënten12. Patiënten met TET2 mutaties weergeven lage niveaus van genomische 5hmC in het beenmerg vergeleken met degenen met wt-TET214. Mutant TET2 knock-in experimente…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van defensie in de vorm van een idee Award (W81XWH-13-1-0174), Aplastic bloedarmoede & MDS Stichting Grant, en toekenning van de UMRB aan M.M. Authors Mohit Jaiswal en Subhradeep Bhar bedanken voor het eerste klonen van TET2 in pDEST14 vector.
HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
LB Media | Affymetrix | J75852 | |
IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
HPLC | Shimadzu HPLC | ||
XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |