Purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no LC-MS/MS para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para uma purificação eficiente passo a passo do ativo humano sem marcas de formatação a translocação de 10-11-2 (TET2) 5-metilcitosina dioxigenase usando cromatografia de permuta iónica e seu ensaio usando uma massa em tandem-cromatografia líquida espectrometria (LC-MS/MS)-com base em abordagem.
Abstract
O Regulamento epigenéticas transcrição mediado por 5-metilcitosina (5mC) tem desempenhado um papel crítico no desenvolvimento de eucariota. Desmetilação destas marcas epigenéticas é realizada pela oxidação sequencial por dez-onze translocação dioxygenases (TET1-3), seguida-se o reparo de excisão de base glycosylase-dependente de timina-DNA. Inativação do gene TET2 devido a mutações genéticas ou por outros mecanismos epigenéticos está associada um mau prognóstico em pacientes com diversos tipos de câncer, especialmente malignidades hematopoiéticas. Aqui, descrevemos uma purificação eficiente passo a passo de dioxigenase TET2 enzimaticamente ativo não marcado humano usando a cromatografia de permuta catiónica. Nós fornecemos mais uma abordagem de líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS) que pode separar e quantificar as quatro bases de DNA normais (A, T, G e C), bem como as quatro bases citosina modificado (5-metil, 5-hidroximetil, formil-5 e 5-carboxila). Este ensaio pode ser usado para avaliar a atividade de tipo selvagem e mutante TET2 dioxygenases.
Introduction
A posição de C5 de bases citosina dentro dinucleotídeos CpG é o site de metilação predominante (5mCpG) em genomas de mamíferos1. Além disso, uma série de estudos recentes revelaram extensa C5 methylation do cytosine (5mC) em sites não-CpG (5mCpH, onde H = A, T, ou C)2,3. modificação de 5mC serve como um silenciador transcriptional em retrotransposons endógena e gene promotores3,4,5. Metilação do DNA no 5mC também tem um papel importante na inactivação do cromossoma X, impressão de gene, reprogramação nuclear e expressão de genes tecido-específica a5,6,7. Metilação de citosina na posição C5 é efectuada pelas metiltransferases do DNA e mutações nestas enzimas causam defeitos significativos do desenvolvimento8. A remoção de marcas de 5mC são iniciadas por TET1-3 5mC oxidases9,10. Estes dioxygenases TET-família converter 5mC em 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) por oxidação sequencial passos11,12,13. Finalmente, a timina-DNA glycosylase substitui 5fC ou 5caC de citosina não modificada usando o reparo de excisão de base via11.
O gene humano que TET2 foi identificado como um gene frequentemente mutado em diversas malignidades hematopoiéticas incluindo mielodisplásica síndromes (MDS)14,15,16, MDS-mieloproliferativa (Neoplasias MDS-MPN) e a leucemia mieloide aguda (LMA) provenientes de MDS e MDS-MPN16. Os níveis de 5hmC modificação na medula óssea DNA são mais baixos em pacientes com mutações TET2 em comparação com aqueles com tipo selvagem (wt)-TET214. Um número de grupos desenvolveram modelos de rato TET2-nocaute para elucidar seu papel na hematopoiese normal e transformação mieloide17,18,19,20. Estes ratos com mutações no gene TET2 foram inicialmente normal e viável, mas se manifesta diversas malignidades hematopoiéticas, medida que envelheciam, causando sua morte precoce. Estes estudos mostraram o importante papel desempenhado pelo wt-TET2 na diferenciação hematopoiética normal. Estes modelos de rato, heterozigotos as células-tronco hematopoiéticas (TET2+ /- linfócitos) e homozigotos TET2– / – linfócitos tinham uma vantagem competitiva sobre linfócitos homozigotos wt-TET2 no repovoamento linhagens hematopoiéticas como ambos TET2+ /- e TET2– / – linfócitos desenvolveu diversas malignidades hematopoiéticas17,18. Estes estudos demonstram essa haploinsuficiência do TET2 dioxigenase altera o desenvolvimento dos linfócitos e resulta em malignidades hematopoiéticas.
Semelhante a camundongos com mutações no gene TET2, a maioria dos pacientes de leucemia manifesto haploinsuficiência TET2 dioxigenase atividade. Estas mutações somáticas principalmente heterozigotas incluem mutações quadro-shift e absurdo, dispersadas por todo o corpo de gene TET2 enquanto mutações missense que são mais agrupado no domínio dioxigenase12. Até à data, pouco caracterização de wt – e mutante-TET2 é relatada na literatura principalmente devido às dificuldades com a produção de dioxigenase TET2 e seu ensaio21. Aqui, nós relatamos uma simples purificação de etapa única de nativo TET2 dioxigenase usando cromatografia de troca iónica. Além disso, um ensaio quantitativo de LC-MS/MS foi otimizado e usado para medir a atividade enzimática de nativo TET2 dioxigenase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutações no gene TET2 são algumas das alterações genéticas mais frequentemente detectadas em pacientes com diversas malignidades hematopoiéticas. Até à data centenas de mutações TET2 diferentes, que incluem o absurdo, deslocamento de quadro e mutações missense, foram identificados em pacientes12. Pacientes com mutações TET2 mostram níveis baixos de 5hmC genômica na medula óssea, em comparação com aqueles com wt-TET214. TET2 mutantes bat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo departamento de defesa sob a forma de um prêmio Idea (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplástica e MDS Foundation Grant, e grant UMRB M.M. Authors agradecer Mohit Jaiswal e Subhradeep Bhar clonagem inicial de TET2 no vetor pDEST14.
Materials
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
References
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