Purificazione efficiente e sviluppo di analisi LC-MS/MS-based per dieci-undici traslocazione-2 5-metilcitosina diossigenasi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per una purificazione efficiente unico passaggio dell’essere umano senza tag attivo dieci-undici traslocazione-2 (TET2) 5-metilcitosina diossigenasi usando la cromatografia a scambio ionico e sua analisi utilizzando una massa liquida di cromatografia-tandem spettrometria (LC-MS/MS)-approccio basato.
Abstract
La regolazione della trascrizione epigenetica mediata da 5-metilcitosina (5mC) ha svolto un ruolo critico nello sviluppo eucariotico. Demetilazione di questi segni epigenetici avviene mediante ossidazione sequenza di dieci-undici traslocazione diossigenasi (TET1-3), seguita dalla riparazione bassa di asportazione glicosilasi-dipendente timina-DNA. Inattivazione del gene TET2 a causa di mutazioni genetiche o da altri meccanismi epigenetici è associato con una prognosi difficile in pazienti con diversi tipi di cancro, specialmente malignità ematopoietiche. Qui, descriviamo una purificazione efficiente singolo passaggio di enzimaticamente attivo dioxygenase di TET2 umana senza tag mediante cromatografia a scambio cationico. Forniamo inoltre un approccio liquido cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS) che può separare e quantificare le quattro basi di DNA normale (A, T, G e C), così come le quattro basi modificate citosina (5-metil, 5-idrossimetil, 5-formil e 5-carbossilico). Questa analisi può essere usata per valutare l’attività del wild type e mutanti TET2 diossigenasi.
Introduction
La posizione di C5 della citosina basi all’interno di dinucleotidi CpG è il sito di metilazione predominante (5mCpG) nel genoma di mammiferi1. Inoltre, una serie di studi recenti hanno scoperto vasta metilazione della citosina C5 (5mC) in siti non-CpG (5mCpH, dove H = A, T, o C)2,3. modifica di 5mc serve come un silenziatore trascrizionale retrotrasposoni endogeno e gene promotori3,4,5. La metilazione del DNA a 5mC inoltre svolge ruoli importanti nell’inattivazione del cromosoma X, gene imprinting, riprogrammazione nucleare e genica tessuto-specifica espressione5,6,7. La metilazione della citosina nella posizione C5 è svolta da methyltransferases del DNA e le mutazioni in questi enzimi causano difetti inerenti allo sviluppo significativo8. La rimozione di segni di 5mC vengono avviate da TET1-3 5mC ossidasi9,10. Questi diossigenasi TET-famiglia convertono 5mC in 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) di ossidazione sequenziale passaggi11,12,13. Infine, timina-DNA glicosilasi sostituiscono 5fC o 5caC a citosina non modificato utilizzando riparazione bassa di asportazione percorso11.
Il gene TET2 umano è stato identificato come un gene mutato frequentemente in varie malignità ematopoietiche compreso myelodysplastic (MDS) le sindromi14,15,16, neoplasie mieloproliferative MDS ( MDS-MPN) e leucemia mieloide acuta (AML) provenienti da MDS e MDS-MPN16. I livelli di modificazione di 5hmC nel midollo osseo del DNA sono più bassi nei pazienti con mutazioni di TET2 rispetto a quelli con wild type (wt)-TET214. Alcuni gruppi hanno sviluppato modelli murini TET2 knock-out per delucidare il suo ruolo nell’ematopoiesi normale e trasformazione mieloide17,18,19,20. Questi topi con mutazioni del gene TET2 erano inizialmente normale e praticabile, ma manifesta varie malignità ematopoietiche come età causando la loro morte prematura. Questi studi hanno dimostrato il ruolo importante svolto da wt-TET2 nel differenziamento ematopoietico normale. In questi modelli di topo, cellule staminali ematopoietiche eterozigoti (TET2+ /- HSCs) e omozigotica TET2– / – HSCs aveva un vantaggio competitivo rispetto omozigoti wt-TET2 HSCs a ripopolare filiere emopoietiche come entrambi TET2+ /- e TET2– / – HSCs sviluppato varie malignità ematopoietiche17,18. Questi studi dimostrano che il haploinsufficiency di TET2 diossigenasi altera lo sviluppo di HSCs e risultati nelle malignità ematopoietiche.
Simili ai topi con mutazioni del gene TET2, maggior parte dei pazienti affetti da leucemia manifestano haploinsufficiency di TET2 diossigenasi attività. Queste mutazioni somatiche principalmente eterozigoti comprendono mutazioni frame-shift e sciocchezze dislocate in tutto il corpo del gene TET2 mentre mutazioni missenso che sono la maggior parte dei cluster nel dominio diossigenasi12. Fin qui, poco caratterizzazione di TET2 wt e mutante è segnalato nella letteratura principalmente a causa di difficoltà con la produzione di TET2 diossigenasi e relativi test21. Qui, segnaliamo un semplice singolo passaggio di purificazione del nativo dioxygenase di TET2 mediante cromatografia a scambio ionico. Ulteriormente, un dosaggio quantitativo di LC-MS/MS è stato ottimizzato e utilizzato per misurare l’attività enzimatica di nativo TET2 diossigenasi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutazioni nel gene TET2 sono alcuni dei cambiamenti genetici più frequentemente rilevati in pazienti con malignità ematopoietiche diversificata. Ad oggi centinaia di diverse mutazioni di TET2, sono sciocchezze, frame-shift e mutazioni di senso sbagliato, sono state identificate in pazienti12. Pazienti con mutazioni di TET2 mostrano bassi livelli di genomica 5hmC nel midollo osseo rispetto a quelli con wt-TET214. TET2 mutante knock-in esperimenti hanno ri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dal dipartimento della difesa sotto forma di un’Idea Award (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplastica & MDS Foundation Grant e grant UMRB a M.M. Authors ringraziare Mohit Jaiswal e Subhradeep Bhar per clonazione iniziale di TET2 nel vettore pDEST14.
Materials
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| α-Ketoglutaric acid (2-Oxoglutaric acid) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo clean and concentrator | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nuclease | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Calf intestinal alkaline phosphatase) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB Media | Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate] | Carbosynth | FM37015 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Deoxy-5-methylcytidine | TCI | D3610 | |
| 2'-Deoxy-5-hydroxymethyalcytidine | TCI | D4220 | |
| 2'-Deoxycytidine-5-carboxylic acid, sodium salt | Berry & Associates | PY 7593 | |
| 5-Formyl-2'-deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Associates | PY 7216 | |
| 2'-Deoxyadenosine | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Deoxyguanosine | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Deoxythymidine | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Gateway technology | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Sonic Dismembrator 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| ÄKTA FPLC system | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| FreeZone 4.5 freeze dry system | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo purification columns | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 column | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap mass spectrometer | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 FPLC column | Pharmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
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