JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologie et infection

الجمع بين تحليل للحمض النووي في مجال استخراج النفط خام Virion بتحليل الحمض النووي الريبي من الأوراق المصابة اكتشاف جينومات الفيروس الجديد

Published: July 27, 2018
doi:
10.3791/57855
, , ,
1Texas A&M Agrilife Center at Dallas, 2Noble Research Center,Oklahoma State University, 3Department of Biology, College of Engineering and Natural Sciences,The University of Tulsa, 4Bioinformatics and Genomics Core Facility, Department of Biochemistry and Molecular Biology,Oklahoma State University

Summary

وهنا يقدم نهجاً جديداً للتعرف على الفيروسات النباتية مع مورثات الحمض النووي المزدوج-حبلا. نحن نستخدم الطرق القياسية لاستخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي من الأوراق المصابة وإجراء تسلسل الجيل القادم. أدوات Bioinformatic تجميع تسلسل في كونتيجس، وتحديد كونتيجس يمثلون جينوم الفيروس وتعيين الجينوم للمجموعات التصنيفية.

Abstract

يتم استخدام هذا النهج ميتاجينومي للتعرف على الفيروسات النباتية مع التعميم الحمض النووي الجينوم وتلك النصوص. ويصعب غالباً فيروسات الحمض النووي النباتية التي تحدث في انخفاض التتر في المضيفة لهم، أو لا يمكن تلقيح ميكانيكيا لمضيف آخر للنشر إلى تحقيق من عيار أكبر من المواد المعدية. الأوراق المصابة هي أرض الواقع في منطقة عازلة خفيفة مع الرقم الهيدروجيني الأمثل والأيونية تكوين الموصى بها لتنقية معظم الفيروسات التراجعية في الفقرة باسيليفورم. يتم استخدام اليوريا إلى تفريق إدراج الهيئات التي اعتراض فيريونس وحل المكونات الخلوية. الطرد المركزي التفاضلي توفر مزيدا من فصل فيريونس عن الملوثات النبات. ثم يزيل العلاج بروتيناز ك كابسيدس. ثم ركزت الحمض النووي الفيروسي واستخدامها للجيل التالي التسلسل (خ ع). وتستخدم البيانات خ ع لتجميع كونتيجس التي تقدم إلى نكبي-بلاستن لتحديد مجموعة فرعية تسلسل الفيروس في مجموعة البيانات الذي تم إنشاؤه. في خط مواز، الجيش الملكي النيبالي معزول من يترك المصاب باستخدام أسلوب استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى عمود قياسي. ثم يجري استنفاد الريبوسوم لإثراء لمجموعة فرعية نصوص مرناً والفيروسات. تجميع تسلسل المستمدة من الحمض النووي الريبي التسلسل (الحمض النووي الريبي-seq) قدمت إلى نكبي-بلاستن لتحديد مجموعة فرعية تسلسل الفيروس في dataset هذه. وفي دراستنا، حددنا الجينوم بادنافيروس كامل طول يتصل اثنان في مجموعات البيانات اثنين. هذا الأسلوب المفضل لنهج مشترك آخر الذي يستخرج السكان الكلي لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة إعادة تشكيل الفيروس مصنع تسلسل الجينوم. هذا الفيروس يستعيد خط أنابيب الجينومية الأخيرة المتعلقة بتسلسل أن يتم إدراج العناصر الرجعية تدوين في جينوم النبات. ويقترن هذا بفحوصات الكيمياء الحيوية أو الجزيئية زيادة تمييز العوامل المعدية بنشاط. النهج الموثقة في هذه الدراسة، يسترد متواليات الممثل تكرار الفيروسات التي يرجح أن تشير إلى الإصابة بعدوى الفيروس النشط.

Introduction

أمراض النباتات الناشئة محرك الباحثين لتطوير أدوات جديدة للتعرف السببية الصحيحة (المحليون). تستند التقارير الأولية من الأمراض الفيروسية الجديدة أو المتكررة على الأعراض التي تحدث عادة مثل الفسيفساء والتشوهات ليف، الوريد مسح، والتقزم، ذبول، والآفات، نخر، أو أعراض أخرى. القياسية للإبلاغ عن ظهور فيروس جديد كما وكيل المسببة لمرض فصله من مسببات الأمراض تلويث أخرى، نشر في مناسبة المضيف، واستنساخ هذا المرض بتطعيم في منشآت صحية من الأنواع المضيف الأصلي. القيد في هذا النهج أن أجناس العديد من الفيروسات النباتية تعتمد على الحشرات أو ناقلات أخرى لانتقال العدوى إلى مضيف مناسب أو العودة إلى الأنواع المضيف الأصلي. في هذه الحالة، يمكن أن يطول البحث عن ناقلات مناسبة، قد تكون هناك صعوبات إقامة المستعمرات مختبر مكافحة ناقلات، وتبذل المزيد من الجهود اللازمة لوضع بروتوكول للبث التجريبي. وإذا تعذر تحقيق الشروط اللازمة للدراسات المختبرية نجاح الإرسال، ثم العمل يقصر عن المعيار للإبلاغ عن مرض فيروس جديد. للبحث عن الفيروسات التي تحدث في مضيفيهم الطبيعية في التتر منخفضة جداً، يجب تحديد الباحثين المضيفين البديلة للنشر للحفاظ على مخزونات المعدية كافية لإجراء البحوث. أنواع الفيروسات التي تصيب النباتات قليلة فقط وهذا يمكن أيضا عائقا لنمو الثقافات الأسهم1.

في السنوات الأخيرة، هي أكثر في كثير من الأحيان أن توظيف العلماء خ ع الفائق والنهج الجينومية للكشف عن تسلسل الفيروس الموجودة في البيئة، والتي قد تكون موجودة لا علاقة لها بمرض معروف، ولكن يمكن تعيينها إلى الأنواع التصنيفية وأجناس 2 , 3 , 4-هذه النهج لاكتشاف وتصنيف المواد الجينية في بيئة متميزة توفر طريقة لوصف تنوع الفيروسات بطبيعتها أو وجودها في نظام إيكولوجي معين ولكن لا تؤكد بالضرورة إلى وضع إطار لتحديد العوامل السببية لمرض الظاهر.

جنس بادنافيروس ينتمي إلى عائلة كوليموفيريداي باراريتروفيروسيس. هذه الفيروسات باسيليفورم في الشكل مع جينوم الحمض النووي حبلا مزدوجة دائرية من 7 إلى 9 كيلو بايت تقريبا. باراريتروفيروسيس جميع النسخ المتماثل من خلال وسيط الجيش الملكي النيبالي. باراريتروفيروسيس قائمة بوصفها ابيسوميس، وتكرار مستقلة من النباتات الصبغية الحمض النووي5،6. دراسات ميدانية للفيروس السكان تشير إلى أن هؤلاء السكان فيروس وراثيا المعقدة. وبالإضافة إلى ذلك، كشفت معلومات تم الحصول عليها عبر مجموعة من جينوم النبات بتسلسل الإنتاجية العالية أمثلة عديدة من أجزاء الجينوم بادنافيروس إدراجها بأحداث التكامل غير شرعي في جينومات النباتات. هذه التسلسلات بادنافيروس الذاتية لا ترتبط بالضرورة بالعدوى7،،من89،،من1011. وفي وقت لاحق، استخدام خ ع لتحديد بادنافيروسيس الجديد كعامل سببية المرض يعقدها يتدنى تنوع الجينوم ابيسومال، فضلا عن حدوث تسلسل الذاتية12،13.

أن هناك لا أحد أنابيب الأمثل لاكتشاف الجينوم باراريتروفيروس الرواية، فهناك نهجان مشتركة لتحديد هذه الفيروسات كالعوامل المسببة للمرض. أسلوب واحد هو إثراء لتسلسل الحمض النووي الريبي صغيرة من الأوراق المصابة وثم تجميع هذه التسلسلات إعادة تشكيل الفيروس genome(s)14،15،،من1617. وثمة نهج آخر هو التضخيم دائرة المتداول (RCA) لتضخيم جينومات الفيروس الحمض النووي الدائري18. يتوقف نجاح RCA سن الورقة وعيار الفيروس في الأنسجة المختارة. المنتجات RCA تخضع لقيود الهضم والمستنسخة في والبلازميدات لمباشرة تسلسل19،،من2021.

فيروس رقش أصفر القنا هو بادنافيروس (كايمف) ويوصف بأنه قضية المسببة للمرض رقش أصفر في القنا، على الرغم من أن جزء bp 565 الجينوم فقط تم عزل سابقا من المصابين كاناس22. حددت دراسة معاصرة كايمف في بوربوراتا خولنجان (الزنجبيل المزهرة؛ كايمفاب)23. وكان الهدف من هذه الدراسة لاسترداد تسلسل الجينوم بادنافيروس كاملة من الزنابق القنا المصابة. نحن وصف بروتوكول لتنقية الفيروس من النبات الملوثات، وثم عزل الحمض النووي الفيروسي من هذا الإعداد، وإعداد مكتبة الحمض النووي لاستخدامها في فئة الخدمات العامة الوطنية. وهذا النهج يلغي الحاجة للخطوات الوسيطة التضخيم الجزيئية. ونحن أيضا عزل مرناً من النباتات المصابة خ ع ما يليها الجيش الملكي النيبالي، الذي يتضمن تسلسل الحمض النووي الريبي أجريت باستخدام كل إعداد الحمض النووي. تم العثور على كونتيجس المجمعة تتصل أصنوفة بادنافيروس في كل مجموعات البيانات باستخدام المركز الوطني للتكنولوجيا الحيوية والمعلومات (نكبي) أداة البحث الأساسية المحلية المحاذاة للأحماض النووية (بلاستن). وقد حددنا الجينوم بادنافيروس اثنين الأنواع24.

Protocol

1. تنقية الفيروس العامة بالطرد المركزي التفاضلي باستخدام أسلوب قياسي من السرب et al. 25 أولاً، خفض 80-100 جرام من أوراق الشجر من النباتات المريضة وتطحن في خلاط أرنج في 4 درجات مئوية باستخدام 200 مل طحن المخزن المؤقت (0.5 م نة2بو4، 0.5 م غ2هبو4 (الرقم الهيدروجيني 7.2). و 0.5% (w/v) Na2هكذا3). ارتداء معطف مختبر وقفازات لكافة الخطوات في هذا الإجراء. ثم قم بنقل هوموجيناتي (300 مل) إلى كوب ل 1.0. إضافة 18 جرام يوريا و 25 مل من المنظفات النطاق 10% (تي–أكتوبر–ج6ح4-أوه9(أوتش2الفصل2)) إلى هوموجيناتي داخل غطاء كيميائية.ملاحظة: لهذه الخطوة فمن الأفضل ارتداء نظارات واقية وقناع التنفس بسيطة للحماية الشخصية. إثارة مع محرض مغناطيسي بإيجاز في هود وتغطية الكأس بإحباط. ثم نقل كوب رقائق المشمولة في غرفة باردة ويقلب مع محرض مغناطيسي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. نقل هوموجيناتي الطرد المركزي الدوار الزجاجات (250 مل الحاويات) وأجهزة الطرد المركزي في دوار زاوية ثابتة في 4,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. في غطاء الأبخرة كيميائية، استعادة المادة طافية والتصفية عن طريق 4 طبقات من القماش القطني. تقسيم هوموجيناتي بين مل 38.5 أنابيب البولي بروبلين أجهزة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي ح 2.5 في 40,000 ز x عند 4 درجة مئوية. بشكل عام، التحقق من وجود بيليه أخضر في الجزء السفلي من الأنبوب وبيليه أبيض على طول الأنبوب. من أجل إيقاف المادة طافية والاحتفاظ بكلا الكريات؛ وضع العينات في الثلج.ملاحظة: يتضمن بيليه الأخضر المعايشة، النشا، والعضيات الأخرى. تعمل في غطاء كيميائية، استخدم شرطي مطاط لفصل الكريات. ريسوسبيند بيليه الأبيض في كل زجاجة الدوار في 1 مل من ddH2س على مدى ح 1-2 مع الحفاظ على أن الإيقاف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية للسماح للمواد التي تذوب تماما في الحل. الطرد المركزي بتعليق مبلغ 000 6 × ز وعند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإزالة الحطام المتبقية. الطرد المركزي بتعليق مركزة في 136,000 س ز 2 ح في 4 درجات مئوية بيليه فيريونس. ريسوسبيند الكريات في 1 مل من المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 5 ملم مجكل2).ملاحظة: خطوة اختيارية لعلاج فيريونس مع الدناز أنا (10 ميكروغرام/مل) لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية لإزالة الحمض النووي غير انكابسيداتيد، أي تلويث بلاستيدات الخضراء والحمض النووي. ثم إلغاء تنشيط الدناز أنا بإضافة أدتا إلى 1 مم. تعطيل virions مع 40 ميليلتر من 2 ميكروغرام/ميليلتر بروتيناز ك في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. العمل داخل غطاء كيميائية استرداد virion الحمض النووي عن طريق استخراج العضوية. ارتداء درع وجه وقفازات ومعطف مختبر أثناء الاستخراج للحماية من الآثار الصحية الحادة المحتملة. إضافة إلى حجم 1 من الكحول الفينول-كلوروفورم-إيسواميل (49:50:1) للعينة ويهز باليد للطرد المركزي س. 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 16,000 س زاي إزالة المرحلة المائية العليا ونقل إلى أنبوب جديد. كرر هذا الاستخلاص مرتين أو أكثر. التصرف مرحلة العضوية بوضعه في زجاجة زجاج نفايات للتخلص السليم من المواد الكيميائية المؤسسية26. تركيز الحمض النووي باستخدام الإيثانول هطول الأمطار. استخدام تركيز خلات الصوديوم (pH 5.2) النهائي 0.3 متر وحجم 2.5 من الإيثانول 95%. وضع العينات في-20 درجة مئوية لأجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 10-20 دقيقة بيليه الحمض النووي26و 30-60 دقيقة. العمل على مقاعد البدلاء مختبر، ريسوسبيند بيليه الحمض النووي في 1 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات 0.1 ملم (pH 8.0). المدون بتعليق عن طريق عمود ترشيح جل تجاري (تستخدم عادة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تنظيف) لإزالة الأملاح والوزن الجزيئي المنخفض من المواد التي قد تعوق خ ع. تحليل العينات من 1% [اغروس] هلام التفريد استخدام اثيديوم بروميد تلطيخ لعرض جودة الأعمال التحضيرية. تقييم نوعية الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي نانودروب.ملاحظة: نسبة امتصاص العينة في 260 λ و 280 λ بين 2.0 و 1.85 يشير عادة إلى أن الإعداد “نظيفة” من الشوائب، وهو من الجودة المطلوبة. تحليل نوعية الحمض النووي (استخدام pg 5 إلى 10 نانوغرام) استخدام شرائح على أساس الصك التفريد الشعرية.ملاحظة: يظهر جودة الإنتاج قمم نظيفة، تمثل موزعة حسب الحجم على طول المحور السيني شظايا من الحمض النووي. ذروة الارتفاع يشير إلى وفرة الجزء. قمم خشنة الإشارة إلى الأجزاء المتدهورة جزئيا أو الملوثات الكيميائية. جولة منحنيات تمثل مسحه من الحمض النووي التي تشير إلى سوء نوعية 2-المكتبة إعداد استخدام الحمض النووي وعلى أساس مستحلب التضخيم الاستنساخ (امبكر التضخيم) ملاحظة: تعد المكتبة عادة مرفق خ ع الذي ينفذ العمل الموجهة لصالح العملاء. القص حلاً للحمض النووي (> 200 نانوغرام) استخدام البخاخات الذي يحول الحمض النووي للأجزاء. سد المحولات التجارية وفقا للدليل التعليمات27. الاضطلاع بالتضخيم امبكر عينة الحمض النووي وفقا للشركة المصنعة تعليمات28،،من2930. كرر الخطوة يغسل ثلاث مرات، وبعد كل غسل، بيليه الخرز في مينيسينتريفوجي لتجاهل س. 10 المادة طافية بعد كل غسل.ملاحظة: يبدأ الإجراء مع إعداد التقاط الخرز بالغسيل في المخزن المؤقت للغسيل التجارية المتوفرة في المجموعة. ويشيع استخدام امبكر للتضخيم القالب لفئة الخدمات العامة الوطنية. الحرارة تؤذي الحمض النووي الريبي أو عند 95 درجة مئوية عن 2 دقيقة ثم 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. استخدام 200 مليون جزيئات الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي للقبض على 5 مليون الخرز بحجم نهائي في 30 ميليلتر. إعداد عينة وهمية جنبا إلى جنب مع عينات الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي، والقيام بالخطوات التالية مع عينة الحمض النووي، فضلا عن نماذج صورية. تنفيذ الاستحلاب بواسطة فورتيكسينج أنبوب النفط المستحلب لمدة 10 ق بأقصى سرعة ممكنة، ثم صب المحتوى بأكمله (4 مل) في إثارة الأنبوبة متوافق مع الخالطون منصة بلاستيك. مكان الأنبوب إثارة على المنصة لمزيج مستحلب 2,000 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. الاستغناء عن 100 ميليلتر مختبرين مستحلب في كاب 8-قطاع الأنابيب أو في لوحة 96-جيدا. كاب الأنابيب أو ختم اللوحة والقيام باستخدام البرنامج الموصى بها الشركة المصنعة28امبكر.ملاحظة: بعد اكتمال PCR التحقق من الآبار معرفة ما إذا كان المستحلب حالها وثم المضي قدما. تجاهل البئر كامل إذا المستحلب مكسورة. ارتداء معطف معمل والعمل في غطاء كيميائية لجمع الخرز تضخيم الحمض النووي (مصرف التنمية الآسيوي). الفراغ نضح المستحلب من الآبار وجمع الخرز في أنبوب 50 مل. شطف الآبار مرتين مع 100 ميليلتر من الايزوبروبانول ونضح شطف إلى أنبوب 50 مل نفسه. الدوامة جمعها المستحلبات ومصرف التنمية الآسيوي مع الايزوبروبانول لوحدة تخزين نهائي من 35 مل ريسوسبيند. بيليه بنك التنمية الآسيوي في ز 930 x لأدنى 5 إزالة المادة طافية وإضافة 10 مل من تعزيز المخزن المؤقت. دوامة بنك التنمية الآسيوي ويغسل ثم بإضافة الكحول إلى 40 مل الحجم النهائي للطرد المركزي وتجاهل المادة طافية بعد كل غسل وكرر الخطوة يغسل مرتين. القيام بغسل نهائي باستخدام الإيثانول بدلاً من الايزوبروبانول. إضافة تعزيز مخزن مؤقت بحجم 35 مل النهائي ودوامه، وبيليه الخرز في 930 س ز للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية ولكن تترك 2 مل من تعزيز المخزن المؤقت. نقل التعليق إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي والطرد المركزي بإيجاز بيليه بنك التنمية الآسيوي. بعد التخلص من المادة طافية، شطف بيليه بنك التنمية الآسيوي مرتين مع 1 مل من تعزيز المخزن المؤقت. الطرد المركزي وتجاهل المادة طافية بعد كل غسل. لإعداد لإثراء حبة مكتبة الحمض النووي، إضافة 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم ن 1 إلى الخرز. دوامة بنك التنمية الآسيوي، واحتضان ثم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة يغسل مرة واحدة. أضف 1 مل انلينغ المخزن المؤقت، ثم دوامة بنك التنمية الآسيوي، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بإيجاز، الطرد المركزي وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى باستخدام 100 ميليلتر انلينغ المخزن المؤقت. يصلب الإشعال التسلسل للحمض النووي، إضافة ميليلتر 15 ألف Seq التمهيدي وميليلتر 15 بالتمهيدي Seq المنصوص عليها في هذه المجموعة. باختصار مزيج من فورتيكسينج ووضع أنبوب ميكروسينتريفوجي في كتلة حرارة عند 65 درجة مئوية للحد الأدنى 5 نقل الجليد لمدة 2 دقيقة. تغسل ثلاث مرات مع 1.0 مل من الصلب المخزن المؤقت. دوامة 5 s وتجاهل المادة طافية في كل مرة. قبل التسلسل، قياس عدد حبات استخدام عداد حبة تجارية. ينبغي أن يكون هناك على الأقل 500,000 الخرز المخصب.ملاحظة: عداد حبة هو جهاز خاص يقيس الخرز في أنبوب ميكروسينتريفوجي التي تم توفيرها. 3-العامة مرناً والعزلة ودسدنا “التوليف بدءاً من المصابين القنا يترك” أن اختبار قبل RT-PCR “كايمف باستخدام أفادت التشخيص كبسولة تفجير” ارتداء معطف مختبر وقفازات مطاط للحماية الشخصية في جميع الخطوات اللاحقة. يعمل في هيئة مختبرات، جمع العينات 12 من الأوراق ويغرق العينات في نيتروجين سائل. استخدام طاحونة حبة للتجانس. استخدام أدوات تجارية توفر أسلوب يستند إلى عمود قياسي للنبات مجموع عزل الحمض النووي الريبي. إضافة تحلل جوانيداين-isothiocyanate المخزن المؤقت المقدمة من الطقم إلى عينة الأرض واهتز ل 20 ثانية. إضافة الإيثانول ومزيج دقيق، وفقا لتعليمات كيت. إضافة كل هوموجيناتي إلى عمود دوران الذي يربط بين الجيش الملكي النيبالي للغشاء. تغسل ثلاث مرات والوت الجيش الملكي النيبالي في أنبوب استرداد24. التحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي قياس نسبة امتصاص 260 λ والتحقق من الجيش الملكي النيبالي سلامة 280 λ. استخدام 1% [اغروس] هلام التفريد ملطخة اثيديوم بروميد.ملاحظة: نسبة امتصاص بين 2.0 و 1.85 يشير إلى أن الإعداد من الجودة المطلوبة. تعامل الجيش الملكي النيبالي مع الدناز أنا (10 ميكروغرام/مل) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. استخدام عمود دوران تجاري إلى تركيز الحمض النووي الريبي في المياه خالية من رناسي31. تجمع الجيش الملكي النيبالي العينات قبل المتابعة. استخدام مجموعة مواد إزالة الرنا الريباسي لإزالة النباتات الرنا الريباسي. اليكووت الخرز المغناطيسي إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي ويغسل مرتين مع خالية رناسي المياه. ضع الأنبوب على الوقوف مغناطيسي دوامة أنبوب اليكووت ريسوسبيند، والانتظار للسائل لمسح. تجاهل المادة طافية واستبدل بالحل استثارة حبة المغناطيسية. دوامة ريسوسبيند وإضافة 1 ميليلتر من “رناسي المانع”.ملاحظة: تستخدم هذه مجموعات اليغو-dT منضمة إلى الخرز المغناطيسية التي هجن مرناً. يستخدم الأسلوب المغناطيس القياسية حبة فصل التكنولوجيا لاستعادة النصوص24. ضم 500 نانوغرام إلى 1.25 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي، المياه خالية من رناسي، ورد فعل المخازن المؤقتة المقدمة من هذه المجموعة. وضع الخليط لمدة 10 دقائق في 50 درجة مئوية. إزالة من الحرارة وإضافة الخرز المغناطيسي غسلها في الماء رناسي مجاناً. الدوامة بإيجاز ومجموعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع على الوقوف مغناطيسية وانتظر للسائل لمسح. نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة. تعيين على الجليد. استخدام أسلوب التقاط على أساس الحل لتخصيب اليورانيوم من اكسوسوميس و 200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لإعداد المكتبة كدنا.ملاحظة: تعد المكتبة كدنا حبلا مزدوجة عادة مرفق خ ع الذي ينفذ العمل الموجهة لصالح العملاء. جزء من الجيش الملكي النيبالي استخدام حل تجزؤ الحمض النووي الريبي تجاري (0.136 ز زنكل2 و 100 ملم تريس-HCl pH 7.0). إضافة 2 ميليلتر للحل إلى 18 ميليلتر من الحمض النووي الريبي (200 نانوغرام المجموع). تدور أنابيب بإيجاز في ميكروسينتريفوجي، ووضع العينات في 70 درجة مئوية 30 ثانية، ونقل الجليد. وقف رد الفعل باستخدام 2 ميليلتر من 0.5 م يدتا pH 8.0 و 28 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl درجة الحموضة 7.5. ربط الحمض النووي الريبي الخرز المغناطيسي بالاختلاط في درجة حرارة الغرفة عن 10 دقيقة استخدام مركز مغناطيسي إلى جمع الخرز وتجاهل المادة طافية. أغسل حبات ثلاث مرات مع 200 ميليلتر من الإيثانول 70%. تجاهل كل غسل وثم الهواء الجاف الخرز الأعلاف في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 3 ريسوسبيند في 19 ميليلتر من pH 7.5 من 10 ملم تريس-HCl. يصلب الإشعال العشوائي للجيش الملكي النيبالي مجزأة بالتدفئة إلى 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ومن ثم ضع الأنبوب على الجليد حبلا تحضير الأول 2 دقيقة والثانية كدنا حبلا استخدام عدة توليف كدنا تجارية قياسية. تنقية كدنا حبلا مزدوجة باستخدام مركز حبة مغناطيسية. يغسل مع 800 ميليلتر من الإيثانول 70% ثلاث مرات. تجاهل كل غسل والهواء الجاف الكريات في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 3 ريسوسبيند في 16 ميليلتر من pH 7.5 من 10 ملم تريس-HCl. استخدام مركزات حبة المغناطيسي لفصل الخرز من كدنا مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل، والآن في الحل. إزالة كدنا قبل بيبيتينج في أنبوب بكر 200 ميليلتر جديدة. القيام بإصلاح نهاية جزء باستخدام [تق] [بولمرس]، وخليط من ديوكسيريبونوكليوتيديس المقدمة من مجموعة إعداد مكتبة تجارية. توفر هذه المجموعة التجارية محولات المخفف قبل إضافة إلى نهاية كل من كدنا حبلا مزدوجة باستخدام ليجاسى التجارية عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. 4. خ ع من “الحمض النووي مكتبة وأعد” من “إعداد الفيروس الخام” ودسدنا “أعدت المكتبة” من مرناً استخدام أداة بيروسيكوينسينج قياسية عالية إنتاجية واتباع بروتوكولات الموصى به كل المصنعين لتوليد قراءات مباشرة من تسلسل الحمض النووي. استخدام الكواشف التسلسل التجاري، بما في ذلك النيوكليوتيدات المسمى فلوريسسينتلي.ملاحظة: للتفاصيل، راجع إرشادات الشركة المصنعة مع الصك. القيام بتحليل التسلسل بعد استخدام برامج الجمعية الجينوم الذي تلقائياً بتجميع ما يلي لإنتاج أول مجموعة من كونتيجس مع متوسط طول < 700 هناك استخدام البرمجيات فاستقك على موقع إيبلانت/سيفيرسي الذي يقوم بمراقبة الجودة التحقق من البيانات الخام تسلسل32. حدد تسلسل مع تطوير عشرات ≥ 30 على مواصلة إعادة بناء سلاسل أطول من تسلسل أصغر ما يلي:24 باستخدام رسم الخرائط والبرمجيات أمبليكون.ملاحظة: للتفاصيل، راجع تعليمات الشركة المصنعة. تقدم هذه كونتيجس المجمعة لتحليل نكبي-بلاستن باستخدام الوحدة النمطية الافتراضية ميجابلاست، فضلا عن فيريدبلانتاي (تاكسيد: 33090) والفيروسات (تاكسيد: 10239) كما يحد العضوي أسماء33. جمع يتدنى كونتيجس التي تظهر التشابه عالية للجينوم بادنافيروس المبلغ عنها في تقرير. تحقق من أن السقالات انضم تمثل جينومات الفيروس كامل طول مرشح واحد أو أكثر، تنتج بشكل صحيح في إطار تسلسل التي لها نفس المؤسسة الجينوم بادنافيروس القياسية. للقيام بذلك، إدخال جينوم الفيروس كامل طول المرشح في بلازميد برامج الرسم. قم بتأكيد النيوكليوتيدات أولاً 15 يتكون من الحمض الريبي النووي النقالاجتمع (تجتاتكاجاجكجاج) الذي هو الغاية المصانة بين بادنافيروسيس. قم بتحديد موقع إشارة بوليادينيليشن المحتملة بالقرب من نهاية 3 ‘ الجينوم. إضافة تعليق توضيحي الجينوم الكامل لتحديد وجود اثنين Orf الصغيرة و ORF كبير واحد ترميز بوليبروتين. ثم استخدم المدخل اكسباسي ترجمة أداة لتحديد بادنافيروس ORF1، ORF2، و ORF3 منتجات الترجمة34.ملاحظة: هذا البرنامج العلمي مجاناً وسوف تولد الحمض النووي الدائري، وتحديد القراءة فتح كافة إطارات، ويوفر إنتاج فوري للتحقق من أن يمثل التسلسل جينوم الحمض النووي الدائري طول كامل. استخدام المصدر المفتوح عدة أدوات المقارنة التسلسل، العضلات وكلوستالو، لمقارنة جينومات الفيروس التي تم الحصول عليها من الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي تحليلات35،36. البحث في قاعدة البيانات النوكليوتيدات نكبي الحصول على تسلسل الجينوم الكامل للأنواع بادنافيروس 30 وتصديرها كمستند بتنسيق.fasta. تحميل تسلسل لبرامج التي تجري التحليل الجيني التطوري لتسلسل جنبا إلى جنب مع تسلسل جينوم الفيروس التي حصل عليها خ ع. إنشاء تسلسل التحالفات وأشجار احتمال أقصى استخدام العضلات37متعددة. 5-نوعية التقييم من حيثياته يسلسل من [بكر] تضخيم لجينوم الفيروس من النباتات المصابة إدخال تسلسل الجينوم بادنافيروس كامل طول المحددة حديثا (الشكل.fasta) إلى أداة Primer3 على الإنترنت مجاناً لاشتقاق [بكر] كبسولة تفجير38. تحديد مجموعات التمهيدي التي سوف تنتج منتجات متعاقبة من شركة بريتيش بتروليوم 1,000-1,500 على الطول من genome(s) الفيروس. إرسال التسلسل إلى مرفق خدمة التي سيتم تجميع وتسليم [بكر] كبسولة تفجير.ملاحظة: يحدد الإخراج أزواج التمهيدي مقبولة مع درجات حرارة ذوبان شائعة ومقبولة ومواقع التمهيدي دقيقة على طول تسلسل عرض. يعمل في هيئة مختبرات وارتداء معطف مختبر، والقفازات، وعزل 5 ميكروغرام من الحمض النووي من أوراق مراقبة صحية والمصابة بالفيروس باستخدام أسلوب الآلي الذي ينطوي على جزيئات السليلوز باراماجنيتيك القياسية لعزل الحمض النووي من مصنع المواد39 . تجميد المواد ورقة (20-40 مغ) في النتروجين السائل في أنبوب ميكروسينتريفوجي وطحن استخدام طاحونة حبة. الجمع بين العينة مع المخزن المؤقت لتحلل في أنبوب ميكروسينتريفوجي وإضافة رناسي A لكل عينة. وتدور دوامة العينة s 10-20 وإيجاز عينة لإزالة الجسيمات الصلبة.ملاحظة: جزيئات السليلوز باراماجنيتيك لها قدرة عالية من الحمض النووي ملزم وعزل عالية الغلة من الحمض النقي. عدم كفاءة أساليب العمود والسليكا التجارية الموحدة لعزل الحمض النووي استخراج الحمض النووي من مجموعة متنوعة واسعة من الأنواع النباتية. ونتيجة لذلك، توجد عشرات الطرق أن يتم إدخال تعديلات على هذه الإجراءات لتحسين الكفاءة للأنواع النباتية الفردية. تم اختيار الأسلوب الجسيمات السليلوز باراماجنيتيك الآلي لغلة الحمض النووي أكثر وأعلى نوعية من الأنواع العشبية مغطاة البذور 25 أكثر من40. استخدام خراطيش كاشف التجارية لعزل الحمض النووي باراماجنيتيك الآلي. إضافة 300 ميليلتر nuclease المياه مجاناً لكل كاشف التجارية خرطوشة ونقل مصنع ليساتي بخرطوشة نفس. ضع الخرطوشة في حامل خرطوشة، وضع المكبس في البئر الأقرب إلى أنبوب شطف ثم ضع شطف المخزن المؤقت في أنبوب شطف. تحميل خراطيش في آلة عزل الحمض النووي الآلي وتشغيل مصنع الحامض النووي العزلة البروتوكول41،42. إجراء PCR لاشتقاق مجموعة من منتجات PCR المتداخلة. استخدام 5 ميكرون لكل إلى الأمام وعكس التمهيدي مع دورات 35 بكر التضخيم. استخدام الدراجات الشروط التالية: تمسخ عند 95 درجة مئوية 60 ثانية والصلب عند 50 درجة مئوية، 45 ثانية، وتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة مع تمديد نهائي في 72 درجة مئوية لأملاح 7-10 دقيقة استخدام عمود ترشيح جل الجاهزة للقضاء على والوزن الجزيئي المنخفض من المواد في الخطوة 1، 231. حساب نسبة مولى 3:1 منتج PCR لناقلات لتحديد كمية المنتج بكر اضطر إلى 50 نانوغرام بجيم خطية بلازميد43. استخدام عنصر تحكم إدخال الحمض النووي لتحديد ما إذا كان ليجيشنز العمل بكفاءة. القيام بعملية ربط بين عشية وضحاها باستخدام الحمض النووي T4 ليجاسى (يو 3/ميليلتر) في 4 درجات مئوية. ثم أعدت تحويل تجارياً JM109 الإشريكيّة القولونية المختصة في الخلايا. استخدام التحكم pg 100 من تقطيعه بلازميد الحمض النووي كعنصر إيجابي لكفاءة التحويل. لوحة 100 ميليلتر من الخلايا المحولة على لوحات أجار رطل مع اختيار المضادات الحيوية وأبيض وأزرق لاسترداد والبلازميدات الواصلة26. احتضان لوحات ح 16-24 عند 37 درجة مئوية.ملاحظة: قد ناقل بجيم لاكز جين الذي يشفر β-جالاكتوسيداسي. تحول البكتيريا نمت على صفيحة تحتوي على 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين، 0.5 مم إيبتج، 80 ميكروغرام/مل 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranosidase (X-غال) سوف تتحول الأزرق بسبب نشاط β-جالاكتوسيداسي. هو خطيا بلازميد بجيم على نحو يعطل الجين لاكز . تعطيل المورثة لاكز المستعمرات التي تحتوي على إدراج المنتج بكر ولا استقلاب X-غال. هذه المستعمرات من البيض. وهكذا يمكن أن تكون متباينة المستعمرات مع إدراج من تلك دون إدراج باللون من مستعمرة (أبيض مقابل الأزرق)26. عزل الحمض النووي من المستعمرات الثلاث باستخدام طقم عزل بلازميد قياسية المستندة إلى العمود39. التسلسل والبلازميدات ثلاثة من التحول المنتج. قارن كل تسلسل الحمض النووي مع جينوم الفيروس حيثياته تجميعها يصدرها خ ع. استخدام كلوستالو لمحاذاة في التسلسل وضمان أن أمروا على نحو ملائم.

Representative Results

وقدمت هذا الأسلوب تنقية الفيروسات المعدلة إثراء للفيروسات المعينة مفيدة لتحديد نوعين من أنواع الفيروسات خ ع والمعلوماتية الحيوية. بعد أن تم طرد في هوموجيناتي في س 40,000 ز ح 2.5، كان هناك من بيليه خضراء في الجزء السفلي من الأنبوب وبيليه أبيض على الطول. كان حراكه بيليه الأخضر إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي واحد وكان حراكه بيليه الأبيض في أنابيب ميكروسينتريفوجي اثنين. بكر أجرى استخدام القياسية PCR كايمف التشخيص الإشعال، وتم الكشف عن المنتجات في سولوبيليزيد بيليه الأبيض ولا بيليه الخضراء (الشكل 1أ). تم فحص عينة من إعداد النفط الخام مجهر إلكتروني ولاحظنا جسيمات باسيليفورم قياس 124-133 نيوتن متر في الطول (الشكل 1ب). هذه حدود طول مشروط توقع معظم بادنافيروسيس. الحمض النووي المستخرج من الكريات البيضاء والخضراء وحراكه بشكل منفصل. في الشكل 1ج، نحن تحميل 5 ميليلتر من الحمض النووي المستخرج من الأخضر وعينه بيليه الأبيض (1.6 ميكروغرام للحمض النووي للكسر الخضراء) و 3.1 ميكروغرام للحمض النووي للكسر الأبيض إلى 0.8% [اغروس] هلام التفريد وتحليل الحمض النووي عقب اثيديوم بروميد تلوين. كسر الأخضر الواردة الوزن الجزيئي المنخفض الحمض النووي حين الكسر الأبيض أنتجت شريطين من ارتفاع الوزن الجزيئي الحمض النووي، فضلا عن انخفاض الوزن الجزيئي الحمض النووي (الشكل 1ج). تم تشغيل هلام المعروضة في الشكل 1ج لمدة 40 دقيقة في 100 الخامس والتشويه في حارة 3 تشير إلى أنه ينبغي خفض الجهد هلام لإنتاج شرائط أكثر وضوحاً. تشير هذه البيانات إلى أن بيليه الأبيض وقد أثري فيريونس. وكان تركيز الحمض النووي (0.6 ميكروغرام/مل) المستخرجة من العينة البيضاء منخفضة، ولكنها كافية لفئة الخدمات العامة الوطنية، الأمر الذي يتطلب حدا أدنى 10 نانوغرام من الحمض النووي المضي قدما. واستخدمت مجزأة السلطات الوطنية المعينة ﻹعداد مكتبة خ ع. في موازاة ذلك، تم استخراج الحمض النووي الريبي من النباتات المصابة القنا (الشكل 1د) للحمض النووي الريبي الفائق-ما يليها أجرى سير عمل قياسية لإعداد مكتبة، خ ع، خلق كونتيجس، وتحديد تسلسل الجينوم الفيروسي (الشكل 1ﻫ). وقورنت النتائج الناتج من استخدام الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي كالمواد الأولية. حصلنا على 188,626 يقرأ الحمض الخام من خ ع استخدام الحمض النووي المعزولة من إعداد الفيروس الخام. ما يلي: تم تجميعها في كونتيجس 13,269، وتم استخدام بلاستن للبحث عن مجموعة البيانات نكبي من متواليات النوكليوتيدات (استخدام تاكسيد فيريدبلانتاي: 33090 و “فيروس تاكسيد”: 10239 كالكائنات الحية الحد) (الشكل 1ﻫ). كشفت النتائج نكبي-بلاستن أن 93% كونتيجس دي نوفو تجميع تسلسل الخلوية، 22% لم تكن معروفة، و 0.3% فيروس كونتيجس (الشكل 2أ). أغلبية كونتيجس المصنفة على أنها حددت تسلسل الخلوية المتقدرية أو بلاستيدات الخضراء الحمض النووي. داخل dataset من الفيروسات كونتيجس، 32% كونتيجس الفيروس كانت تتصل بأعضاء كوليموفيريداي (التي لم تكن متواليات بادنافيروس) وكانت تتصل 58% من هذه بادنافيروس. من كونتيجس الفيروسات، 29 في المائة كانت مشابهة جداً (ه < 1 × 10-30) للجينات V17 ORF3 عزل كايمف (EF189148.1) وعزل فيروس باسيليفورم قصب السكر “د باتافيا”، الجينوم الكامل (FJ439817.1)، وإكمال الفيروسات CA الانتصارات الموز (الجينوم KJ013511). ضمن هذه الفئة من السكان، وكانت هناك كونتيجس طويل يشبه اثنين كامل طول الجينوم. الفائق الجيش الملكي النيبالي-seq أنتجت ما يلي تسلسل الفردية تنظيفها 153,488 مع متوسط قراءة طول < 500 هناك الجمعية Contig تخفيض هذا إلى كونتيجس 8,243. هذه قدمت إلى نكبي-بلاستن (استخدام تاكسيد فيريدبلانتاي: 33090 و "فيروس تاكسيد": 10239 كالكائنات الحية الحد) والنواتج التي وضعها 76% من كونتيجس في فئة من النباتات الخلوية متواليات، 23% لم تكن معروفة، وصنفت 0.1% كفيروس كونتيجس ( الشكل 2 ب)-تقرر دراسة أوثق لسكان السكان 0.1% من كونتيجس الفيروس أن 68% من هؤلاء تم تعيينها إلى كاوليموفيريداي (الشكل 2ب). وحددت ثلاثة كونتيجس كبيرة داخل هذه الفئة من السكان مع تشابه عالية (ه < 1 × 10-30) إلى كايمف V17 ORF3 عزل الجينات (EF189148.1)، عزل فيروس باسيليفورم قصب السكر “د باتافيا” والجينوم الكامل (FJ439817.1) والانتصارات الموز الفيروسات CA الجينوم الكامل (KJ013511). دراسة كونتيجس الثلاثة، انضممنا اثنين من هذه لإنتاج جينوم فيروس كامل طول يدوياً. أننا بالمقارنة مع كونتيجس طول جينوم الفيروس التي تنتجها تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي سقالة متبادل تأكيد وجود جينوم الفيروس كامل طول اثنين. جينوم الفيروس كامل طول واحد 6,966 bp سمي مبدئياً القنا رقش أصفر المرتبطة الفيروس 1 (كيماف-1) (الشكل 3أ). أن الجينوم الثاني كان 7,385 بي بي والبديل من كايمف إصابة بوربوراتا خولنجان (كايمف-Ap01) (الشكل 3أ). وأخيراً، استخدمت كبسولة تفجير PCR التي صممت لاستنساخ ~ 1,000 bp جزء من كل الفيروسات، خلطات الكشف عن الجينوم سواء في عدد سكانها 227 القنا النباتات تمثل تسعة أصناف تجارية. في كثير من الحالات الفردية النباتات كانوا مصابين بالفيروسات على حد سواء. نحن نقدم مثالاً لكشف RT-PCR كايماف-1 وكايمف-Ap01 في النباتات 12. ثلاثة من هذه الإيجابية فقط كايمف-Ap01 وتسعة كانت إيجابية بالنسبة لكل الفيروسات (الشكل 3ب). الشكل 1 : فيروس الحمض النووي الاستعدادات وسير العمل خ ع. (أ) [اغروس] (1.0%) جل التفريد 565 الشظايا PCR bp الجينوم كايمف. تم الكشف عن اثنين من المنتجات PCR في عينات من بيليه الأبيض (الممرات 1، 2) ولكن ليس في العينة بيليه الخضراء (لين 3). مراقبة إيجابية (+) يمثل منتج PCR يضخم من النباتات المصابة الحمض النووي التي تم عزلها باستخدام أسلوب تلقائية التي تنطوي على جزيئات السليلوز باراماجنيتيك القياسية. L لين يحتوي على سلم الحمض النووي يستخدم كمعيار لقياس حجم الخطية شرائط الحمض النووي في الممرات عينة. (ب) مثال للجسيمات فيروس شوهدت مجهر إلكتروني في بيليه الأبيض تعافي بتجزئة النفط الخام من يترك القنا المصابة. (ج) [اغروس] (0.8 في المائة) جل التفريد الحمض النووي المستردة من الأخضر (لين 1) والكريات البيضاء (لين 2) أن إيجابية اختبار ببكر في لوحة أ تحديد النقاط الأحمر والأصفر بجوار حارة 2 شريطين الحمض النووي الوزن الجزيئي العالية التي تحدث في جزء صغير أبيض. (د) [اغروس] (1%) هلام التفريد من مجموع الحمض النووي الريبي المستردة بتنقية الحمض النووي الريبي يستند إلى العمود. L لين يحتوي على سلم الحمض النووي يستخدم كمعيار لقياس حجم العصابات الخطي في حارات عينة. لين 1-6 يحتوي على الحمض النووي الريبي معزول من يترك القنا المصابة التي تم تجميعها إلى عينة واحدة لاستنفاد ريبو والجيش الملكي النيبالي-ما يليها (ﻫ) أنابيب التخطيطي العزلة الحمض النووي وإعداد مكتبة، وتسلسلها، والجمعية contig وجينوم الفيروس الاكتشاف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 2 : المخططات الكرونا تصور فئات تصنيفية كونتيجس. (أ) التخطيط على الأيسر يظهر بوفرة وتوزيع كونتيجس التصنيفية تجميعها من إعداد الفيروس الخام. ويصور المخطط الصحيح نسب كونتيجس الفيروسات المرتبطة بالأسرة كوليموفيريداي وجنس بادنافيروس ، وثلاثة من الأنواع ذات صلة وثيقة. (ب) الفريق على اليسار يظهر وفرة كونتيجس المستمدة من تسلسل الحمض النووي الريبي استناداً إلى توزيعها التقسيمي. على اليمين هو الرسم البياني يصور وفرة كونتيجس ضمن سكان كونتيجس الفيروسات المرتبطة بالأسرة كوليموفيريداي وجنس بادنافيروس وثلاثة من الأنواع ذات الصلة عن كثب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- الشكل 3 . وصف الجينوم كايماف-1 وكايمف-Ap01- (أ) تمثيل البيانية رقش القنا الأصفر إقران الفيروس 1 (كيماف) و فيروس رقش أصفر القنا مشابهة للجينوم معزولة عن بوربوراتا خولنجان (كايمف-Ap01)- مواقف النوكليوتيدات 1-10 يتم تحديدها كبداية للجينوم، ويحتوي على الحمض الريبي النووي النقالالتقى موقع anticodon نموذجي من معظم بادنافيروس الجينوم. مواقف التوقف والبدء بترجمة الإطار القراءة المفتوحة (ORF) 1 و 2 متجاورة. هذه البروتينات قد معروف مهامها. ORF3 بوليبروتين التي تحتوي على إصبع الزنك (زنف)، البروتياز (للمحترفين) وعكس المنتسخة (RT) والمجالات “رناسي ح”. هو حفظ تسلسل إشارة poly(A) 3 ‘ لجينوم الفيروس على حد سواء. (ب) تحليل RT-PCR أجريت باستخدام الحمض النووي الريبي معزولة عن أوراق المصابين بالفيروس والإشعال التي تكشف عن كايماف وكايمف-Ap01. في نفس السكان من النباتات 12، ثلاثة كانوا مصابين كايمف-Ap01 فقط، بينما الباقي كانوا مصابين كيماف وكايمف-Ap01. (+) يشير إلى مراقبة إيجابية و (-) تشير إلى المراقبة السلبية. وهذا الرقم استنساخ/المعدلة من ويجاياسيكارا et al. 24 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وقد استخدمت في السنوات الأخيرة مجموعة متنوعة من أساليب لدراسة التنوع البيولوجي الفيروسات النباتية في البيئات الطبيعية التي تشمل إثراء لجسيمات شبيهة بالفيروس (عزام) أو فيروس محدد الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي2،3،44، 45،46 . وتتبع هذه الأساليب تحليل خ ع وبيوينفورماتيك. وكان الهدف من هذه الدراسة للبحث عن عامل المسببة لمرض شائع في النباتات مزروعة. أبلغ هذا المرض نتيجة لفيروس غير معروف يحتوي على جسيمات باسيليفورم غير المغلفة، والتي كانت فقط جزء bp 565 المستنسخة47. هذه المعلومات غير كافية للباحثين السابقة لتعيين الفيروس نظرياً إلى جنس بادنافيروس داخل الأسرة كوليموفيريداي. في حين أن التقارير السابقة عن الافتراض بأن المرض رقش القنا في الزنابق القنا هو نتيجة بادنافيروس واحد، باستخدام النهج metagenomics المبينة في هذه الدراسة، عقدنا العزم أن المرض سببه بادنافيروس مؤقت اثنين الأنواع24. وهكذا، قوة استخدام نهج ميتاجينومي لاكتشاف عامل المسببة للمرض أنه يمكننا الآن تحديد الحالات حيث قد يكون هناك سبب واحد أو أكثر.

لدينا نهج الجمع بين بيانات تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي دقيق ويوضح أيضا أن النتائج باستخدام نهجين أسفرت عن نتائج متسقة، وأكدت وجود اثنين من الفيروسات ذات الصلة. ونحن العاملين إجراء تعديل لعزل كوليموفيروسيس وأنتجت عينة التي تم إثراء للأحماض النووية المرتبطة الفيروس والتي كانت محمية داخل قفيصه الفيروس. وتم التعاقد مع مختبر خدمة الاضطلاع بتسلسل الحمض النووي. مفهوم أساسي لتسلسل حيثياته بوليميراز الدنا أن يدمج الفلورسنت المسمى النيوكليوتيدات في حبلا قالب الحمض النووي خلال دورات متتالية لتركيب الدنا. كونتيجس تجميعها اتباع طريق خ ع قدمت في سير عمل بيوينفورماتيك المنتجة لعدد قليل من كونتيجس التي تم تحديدها كفيروس كونتيجس. تم الحصول على تأكيد آخر للفيروسات اثنين جينومات10،24،،من4849،50 من خلال تحليل الحمض النووي الريبي seq البيانات المتحصل عليها من استعدادات الجيش الملكي النيبالي المنضب ريبو bioinformatic. وقدمت إحدى نتائج مثيرة للاهتمام أن تعلم أن السكان في تسلسل المستردة بتسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي توزيعات مماثلة من الأحماض النووية غير الفيروسية والفيروسية. لتسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، كانت < 0.5% من تسلسل الفيروس الأصلي. ضمن السكان فيروس متواليات 78-82% تنتمي إلى أسرة كوليموفيريداي. بمقارنة كونتيجس الفيروسات المجتمعة من تسلسل الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، أكدنا أن الجينوم المجتمعون اثنين وقعت في مجموعات البيانات على حد سواء.

مصدر قلق لاستخدام تسلسل الحمض النووي فقط لتحديد جينومات الفيروس الجديد هو أن الجينوم بادنافيروس الحمض النووي دائري مفتوح. ونحن من يظن أن متواليات متداخلة ثغرات في الجينوم قد تشكل عقبات للجينوم للجمعية من كونتيجس. وكشفت دراسة أولية لنتائج تسلسل الحمض النووي هما جينوم الفيروس مماثلة. افترضنا أن الجينوم هذه تمثل أما التنوع الوراثي للأنواع التي لم تدرس، أو تمثل نوعين من أنواع المشترك إصابة نفس المصنع24. ولذلك، تمكين تحليل bioinformatic الجماعي لمجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من “خ ع الحمض النووي” والجيش الملكي النيبالي التسلسل، تأكيد وجود اثنين كامل طول الجينوم.

وهناك تقرير آخر الذي وضع طريقة بديلة لاستخراج عزام والأحماض النووية من مصنع هوموجيناتيس للدراسات الجينومية، استناداً إلى إجراءات لاسترداد الحمض النووي من فيروس تبرقش القنبيط (كامب؛ كوليموفيروس)3. وحدد هذا النهج رواية الجيش الملكي النيبالي وتسلسلات فيروس الحمض النووي في النباتات غير المزروعة. الخطوات المستمدة من إجراءات العزل كاوليموفيروس المستخدمة في هذه الدراسة لاكتشاف عامل المسببة لمرض نباتات المزروعة عكس خطوات اشتقاق لاستخراج عزام من النباتات المصابة بطبيعة الحال24. نجاح كلا الأسلوبين تعديل يشير إلى أن الإجراء الإطار للعزلة كوليموفيروس قد تكون نقطة انطلاق قيمة الدراسات الجينومية من الفيروسات النباتية بشكل عام.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد مولت البحوث مركز أوكلاهوما “النهوض بالعلوم” والتكنولوجيا تطبيق البحث برنامج المرحلة الثانية ع 132-053-2؛ ووزارة الزراعة تخصص محاصيل أوكلاهوما برنامج المنح البحثية. ونحن نشكر الدكتور هوانغ هونججين ومرفق الأساسية المعلوماتية الحيوية أوسو الذي كان مدعوما من المنح المقدمة من جبهة الخلاص الوطني (ايوس-0132534)، والمعاهد الوطنية للصحة (2P20RR016478-04، 1P20RR16478-02 و 5P20RR15564-03).

Materials

NaH2PO4 Sigma-Aldrich St. Louis MO S5976 Grinding buffer for virus purification
Na2HPO4 Sigma-Aldrich  S0751 Grinding buffer for virus purification
Na2SO3 Thermo-Fisher Waltham, MA 28790 Grinding buffer for virus purification
urea Thermo-Fisher PB169-212 Homogenate extraction 
Triton X-100 Sigma-Aldrich  X-100 Homogenate extraction 
Cheesecloth VWR Radnor, PA 21910-107 Filter homogenate 
Tris  Thermo-Fisher BP152-5 Pellet resuspension& DNA resuspension buffers 
MgCl2 Spectrum, Gardena, CA M1035 Pellet resuspension buffer
EDTA Spectrum E1045 Stops enzyme reactions
Proteinase K Thermo-Fisher 25530 DNA resuspension buffer
phenol:chloroform:isoamylalcohol  Sigma-Aldrich P2069 Dissolve virion proteins
DNAse I Promega M6101 Degrade cellular DNA from extracts
95% ethanol Sigma-Aldrich 6B-100 Virus DNA precipitation
Laboratory blender VWR 58984-030 Grind leaf samples
Floor model ultracentrifuge  &Ti70 rotor Beckman Coulter, Irving TX  A94471 Separation of cellular extracts
Floor model centrifuge and JA-14 rotor Beckman Coulter  369001 Separation of cellular extracts
Magnetic stir plate VWR 75876-022 Mixing urea into samples overnight
Rubber policeman VWR 470104-462 Dissolve virus pellet
 2100 bioanalyzer Instrument Agilent Genomics, Santa Clare, CA G2939BA Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity
2100 Bioanalyzer RNA-Picochip 5067-1513 Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer
2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip 5067-4626 Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer
Nanodrop spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Plant total RNA isolation kit Sigma-Aldrich STRN50-1KT Isolate RNA for RNA-seq
RNase-free water  VWR 10128-514 Resuspension of DNA and RNA for NGS
RNA concentrator spin column Zymo Research, Irvine, CA R1013 Prepare RNA for RNA-seq
rRNA removal kit Illumina, San Diego, CA MRZPL116 Prepare RNA for RNA-seq
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Prepare RNA for RNA-seq
 RNA  enrichment system Roche 7277300001 Prepare RNA for RNA-seq
Agarose  Thermo-Fisher 16500100 Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures
Ethidium bromide Thermo-Fisher 15585011 Agarose gel staining
pGEM-T +JM109 competent cells Promega, Madison, WI A3610 Clone genome fragments
pFU Taq polymerase Promega M7741 PCR amplify virus genome
dNTPs Promega U1511 PCR amplify virus genome
PCR oligonucleotides IDT, Coralvill, IA Custom order PCR amplify virus genome
Miniprep DNA purification kit Promega A1330 Plasmid DNA purification prior to sequencing
PCR clean-up kit Promega A9281 Prepare PCR products for cloning
pDRAW32 software ACAClone Computer analysis of circular DNA and motifs
MEGA6.0 software MEGA Molecular evolutionary genetics analysis
Primer 3.0 Simgene.com
Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Assay Kit Thermo-Fisher R11490 Fluorometric determination of RNA quantity
GS Junior™ pyrosequencing System Roche 5526337001 Sequencing platform
GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A) Roche 5996520001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents Roche 5996490001 Reagents for emulsion PCR
GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A) Roche 5996538001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr EmPCR Oil & Breaking Kit Roche 5996511001 Reagents for emulsion PCR
GS Jr Titanium Sequenicing kit* Roche 5996554001 Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads
GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit Roche 5996619001 Sequencing plate with associated reagents and gaskets
IKA Turrax mixer 3646000 Special mixer used with Turrax Tubes
IKA Turrax Tube (specialized mixer) 20003213 Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions
GS Nebulizers Kit Roche 5160570001 Nucleic acid size fractionator for use during library preparations
GS Junior emPCR Bead Counter Roche 05 996 635 001 Library bead counter
GS Junior Bead Deposition Device Roche 05 996 473 001 Holder for Picotiter plate during centrifugation
Counterweight & Adaptor for the Bead Deposition Devices Roche 05 889 103 001 Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation
GS Junior Software Roche 05 996 643 001 Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data
GS Junior Sequencer Control v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Run Processor v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS De Novo Assembler v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Reference Mapper v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0 Roche (Included in item 05 996 643 001 above)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dijkstra, J., Jager, C. P. . Practical Plant Virology : Protocols and Exercises. , (1998).
  2. Roossinck, M. J. Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology. Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).
  3. Melcher, U., et al. Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya. J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).
  4. Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay. Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).
  5. Borah, B. K., et al. Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group. Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).
  6. Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences. Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).
  7. Geering, A. D., et al. Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses. J Gen Virol. 86, 511-520 (2005).
  8. Kunii, M., et al. Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution. BMC Genomics. 5, 80 (2004).
  9. Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm. Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).
  10. Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species. Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).
  11. Gayral, P., et al. A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus. J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).
  12. Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora. AoB Plants. 2011, 008 (2011).
  13. Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR. J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).
  14. Singh, K., Talla, A., Qiu, W. Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs. Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).
  15. Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run. J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).
  16. Kreuze, J. F., et al. Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses. Virology. 388 (1), 1-7 (2009).
  17. Zheng, Y., et al. VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs. Virology. 500, 130-138 (2017).
  18. James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa. Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).
  19. Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India. Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).
  20. Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2. Virus Res. 238, 29-34 (2017).
  21. BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses. Viruses. 8 (7), (2016).
  22. Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida. Plant Health Progress. , 2-4 (2004).
  23. Zhang, J., et al. Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii. Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).
  24. Wijayasekara, D., et al. Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease. Virus Res. 243, 19-24 (2018).
  25. Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. Caulimovirus isolation and DNA extraction. Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).
  26. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn. , (1989).
  27. Radford, A. D., et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology. J Gen Virol. 93, 1853-1868 (2012).
  28. Kanagal-Shamanna, R. Emulsion PCR: Techniques and Applications. Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).
  29. Getts, D. R., et al. Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages. J Neuroinflammation. 9, 246 (2012).
  30. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  31. . Gel filtration principles and methods. GE Healthcare. , (2010).
  32. Goff, S., et al. The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology. Frontiers in Plant Science. 2, (2011).
  33. Lin, Z., et al. Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets. J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).
  34. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, 597-603 (2012).
  35. Edgar, R. C. MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity. BMC Bioinformatics. 5, 113 (2004).
  36. Hung, J. H., Weng, Z. Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).
  37. Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review. Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).
  38. Untergasser, A., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), 115 (2012).
  39. Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191 (2013).
  40. Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
  41. Moeller, J. R., et al. Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa. Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).
  42. Grooms, K. . Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa. , (2015).
  43. Nishimori, A., et al. In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection. PLoS One. 12 (4), 0174916 (2017).
  44. Rojas, M. R., Gilbertson, R. L., Roossinck, M. J. . Plant Virus Evolution. 1, 27-51 (2008).
  45. Roossinck, M. J. The big unknown: plant virus biodiversity. Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).
  46. Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery. Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).
  47. Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. . Plant Health Progress. , (2004).
  48. Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.). Archives of Virology. 153 (12), 2263-2272 (2008).
  49. Harper, G., et al. The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda. Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).
  50. Muller, E., Sackey, S. Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences. Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).

Tags

DNA AnalysisCrude Virion ExtractionRNA AnalysisInfected LeavesNew Virus GenomesEnvironmental VirologyBadnavirusesHomogenizationDifferential CentrifugationBio-analyzerLaboratory ProtocolLeaf GrindingUreaDetergentCentrifugationPellet SeparationVirus PurificationDNA Sequencing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Verchot, J., Thapa, A., Wijayasekara, D., Hoyt, P. R. Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes. J. Vis. Exp. (137), e57855, doi:10.3791/57855 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image