癌遺伝子が誘導する老化の中に活性酸素種および分泌老化関連の表現型正常ひと線維芽細胞の定量測定
Summary
細胞内 ROS は、細胞老化の誘導に重要な役割を果たすに示されています。ここでは、細胞の老化にともなう ROS レベルを定量化するための敏感な試金について述べる。伝えられる様々 な加齢に伴う機能不全に貢献する老化関連分泌形質を評価するためのプロトコルをいたします。
Abstract
細胞の老化は、増殖能力や様々 なストレスへの暴露の枯渇に不可逆的な増殖停止の状態を考えられています。最近の研究では、開発、創傷治癒、免疫監視、加齢に伴う組織の機能不全など、様々 な生理的過程に細胞の老化の役割を拡張しています。細胞周期の停止は、細胞の老化の重要な特徴は、増加の細胞内活性酸素種 (ROS) 生産は、細胞老化の誘導に重要な役割を果たすことも実証されています。さらに、最近の研究では、老化細胞が隣接細胞と老化関連の分泌形質 (SASP) を通じて組織に強力な傍分泌活動を示すこと明らかにしました。細胞の老化に対する治療戦略に関する関心の急激な増加は、細胞内 ROS および、SASP など老化メカニズムの正確な理解の必要性を強調しています。ここでは、活性酸素感受性蛍光色素とフローサイトメトリーを使用して H Ras 誘導性細胞老化にともなう細胞内 ROS レベルを定量的に評価するためのプロトコルについて述べる。さらに、mRNA の発現の誘導と SASP 因子の分泌の解析のための高感度技術を紹介します。これらのプロトコルは、さまざまな細胞の老化モデルに適用できます。
Introduction
50 年以上も前、ヘイフリック、ムーアヘッドは、正常な細胞が細胞分裂1数後の増殖能の枯渇に不可逆的な増殖停止を入力することを明らかにしました。この現象は、複製老化として今知られているし、個体老化2と強く相関すると考えられています。DNA の損傷、発癌活性化、酸化ストレスなど、さまざまな細胞のストレスを別の種類の細胞の老化を誘導するために報告されているテロメアの進歩的な侵食は複製老化の主な原因と考えられるが、「老化」や「ストレス老化」と呼ばれます。興味深いことに、時期尚早の老化は、H-ras など BRAF 遺伝子の活性化に強力な腫瘍抑制の役割を果たしています。マウス モデルと人間の組織の研究は細胞老化バイオ マーカーは前癌病変、発癌の Ras および BRAF がアクティブになりますがから開発された悪性の癌では減少した主に存在した強力な証拠を作り出した。これら病変3,4,の5。その高齢化と腫瘍抑制における役割を超えて細胞の老化は、創傷治癒、組織修復、免疫監視および萌芽期の開発6などを含む様々 な生理的プロセスで役割を果たす以前の研究で示されています。
増殖停止は、細胞の老化が7の特徴として広く研究されているが証拠の重要なボディは、その細胞内の活性酸素種 (ROS) は、細胞の老化の8にも貢献して示唆しています。ROS レベルの標高複製老化遺伝子が誘導する老化 (OIS) など、細胞の老化の様々 なタイプの中にもともと数十年前は報告された9,10。もっと直接、H2O2の致死線量と外因性治療は老化11,12誘導します。SOD1 などの活性酸素消去酵素の阻害は早期老化13も発生します。対照的に、周囲の酸素条件を低いし、ROS 清掃遅延老化10,14,15の発症の増加します。これらの結果は間違いなく ROS が重要なメディエーターまたは細胞の老化誘導の決定要因であることを示します。ただし、ROS は細胞の老化や細胞の老化中 ROS レベルを昇格する方法の誘導に貢献方法必要さらに調査。
最近の研究では、老化細胞が隣接細胞や SASP16,17を通じて組織の強力なパラクリン活動あるが明らかにしました。高齢者組織老化細胞組織の加齢に伴う機能障害を介して増殖細胞の自律的枯渇に加えて多くの経路 SASP を通じて推進します。様々 な炎症性要因、組織アーキテクチャの破壊組織恒常性が損なわれ、組織の加齢に伴う機能障害を引き起こす IL-8、TGFβ、およびマトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp)、老化の細胞によって分泌されるが IL-6 など隣接するセル、および無菌性炎症18,19の老化。しかし、SASPs は、生物学的文脈によって有益な効果を持つことができます。さらに、SASPs の担体の性質は、老化細胞型と19のさらなる研究の必要性を強調し、細胞の段階に依存します。
ここでは、OIS の中に細胞内 ROS レベルを評価するため迅速・高感度のフローサイトメトリーを用いた手法について述べる。さらに、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) や ELISA を用いた SASP 因子の分析方法を紹介しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、我々 は H Ras 誘導する老化は WI 38 正常ひと線維芽細胞の中に細胞内 ROS レベルを監視する方法を提案しました。生細胞における細胞内 ROS レベル DCF DA の細胞膜透過性の試薬を用いて測定することができ、フローサイトメトリーします。細胞内取り込みに DCF DA 細胞内エステラーゼによってされたきちん、その後、高い蛍光 2′, 7′-ジクロルフルオレッセン (DCF) を形成する活性酸素に?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は (若い淵金) に韓国の国立研究財団 (2015R1D1A1A01060839) からの助成金によって、韓国政府 (MSIT) によって資金を供給された国立研究財団の韓国 (NRF) の助成金によって支えられた (いいえ 2016R1A2B2008887 号2016R1A5A2007009) (に Jeanho ゆん)。
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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