Oncogene-प्रेरित वार्धक्य के दौरान सामान्य मानव Fibroblasts में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और वार्धक्य-संबद्ध स्रावी Phenotype का एक मात्रात्मक मापन
Summary
Intracellular ROS को सेल्यूलर वार्धक्य की प्रेरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है. यहां, हम सेलुलर वार्धक्य के दौरान ROS स्तर को बढ़ाता के लिए एक संवेदनशील परख का वर्णन । हम भी वार्धक्य-एसोसिएटेड स्रावी phenotype का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो कथित तौर पर विभिन्न आयु-संबंधी शिथिलताओं के लिए योगदान देता है ।
Abstract
सेलुलर वार्धक्य प्रफलन क्षमता या विभिंन तनावों के लिए जोखिम के निकास पर अपरिवर्तनीय विकास की गिरफ्तारी का एक राज्य माना गया है । हाल के अध्ययनों के विकास, घाव भरने, प्रतिरक्षा निगरानी, और उम्र से संबंधित ऊतक रोग सहित विभिन्न शारीरिक प्रक्रियाओं, के लिए सेलुलर वार्धक्य की भूमिका बढ़ा दिया है. हालांकि सेल साइकिल गिरफ्तारी सेलुलर वार्धक्य की एक महत्वपूर्ण पहचान है, एक वृद्धि हुई intracellular प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) उत्पादन भी सेलुलर वार्धक्य की प्रेरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं पड़ोसी कोशिकाओं और ऊतकों पर शक्तिशाली paracrine गतिविधियों का प्रदर्शन एक वार्धक्य के माध्यम से जुड़े स्रावी phenotype (SASP) । सेलुलर वार्धक्य के खिलाफ चिकित्सीय रणनीतियों के बारे में ब्याज में तेज वृद्धि intracellular ROS और SASP सहित वार्धक्य तंत्र, की एक सटीक समझ के लिए की आवश्यकता पर जोर देती है । यहां, हम मात्रात्मक एच रास के दौरान intracellular ROS स्तरों का आकलन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन-प्रेरित सेलुलर वार्धक्य ROS के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई और प्रवाह cytometry का उपयोग कर । इसके अलावा, हम mRNA अभिव्यक्ति और SASP कारकों के स्राव के प्रेरण के विश्लेषण के लिए संवेदनशील तकनीक का परिचय । इन प्रोटोकॉल विभिंन सेलुलर वार्धक्य मॉडल के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
से अधिक ५० साल पहले, Hayflick और मूरहेड से पता चला कि सामांय कोशिकाओं को अपने प्रफलन क्षमता के निकास पर कोशिका विभाजन1की एक निश्चित संख्या के बाद अपरिवर्तनीय विकास की गिरफ्तारी दर्ज करें । इस घटना को अब नकल वार्धक्य के रूप में जाना जाता है और दृढ़ता से जीव2उंर बढ़ने के साथ सहसंबंधी माना जाता है । हालांकि telomeres के प्रगतिशील कटाव प्रतिकृति वार्धक्य का एक प्रमुख कारण माना जाता है, विभिन्न सेलुलर तनाव, जैसे डीएनए क्षति, oncogenic सक्रियण, और ऑक्सीडेटिव तनाव, सेलुलर वार्धक्य के एक अन्य प्रकार के प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया है “समयपूर्व वार्धक्य” या “तनाव प्रेरित वार्धक्य” कहा जाता है । दिलचस्प है, समय से पहले वार्धक्य ऐसे एच के रूप में oncogenes के सक्रियकरण पर एक शक्तिशाली ट्यूमर-दमन भूमिका निभाता है रास और BRAF । माउस मॉडल और मानव ऊतकों के अध्ययन मजबूत सबूत है कि सेल वार्धक्य के oncogenic रास और BRAF सक्रिय कर रहे हैं, लेकिन घातक कैंसर है कि विकसित से कम थे में प्रमुख रूप से उपस्थित थे का उत्पादन किया है ये घाव3,4,5। उंर बढ़ने और ट्यूमर दमन में अपनी भूमिका से परे, सेलुलर वार्धक्य पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है कि घाव भरने, ऊतक की मरंमत, प्रतिरक्षा निगरानी, और भ्रूण विकास6सहित विभिंन शारीरिक प्रक्रियाओं, में एक भूमिका निभाते हैं ।
हालांकि विकास की गिरफ्तारी बड़े पैमाने पर सेलुलर वार्धक्य7, सबूत के एक महत्वपूर्ण शरीर की एक बानगी के रूप में अध्ययन किया गया है पता चलता है कि intracellular प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) भी सेलुलर वार्धक्य8के लिए योगदान देता है । ROS स्तर के सेलुलर वार्धक्य के दौरान विभिन्न प्रकार के उन्नयन, जिसमें प्रतिकृति वार्धक्य और oncogene-प्रेरित वार्धक्य (OIS) शामिल हैं, मूल रूप से दशकों पहले9,10बताया गया था । एक अधिक सीधे, एच2ओ2 के एक घातक खुराक के साथ exogenous उपचार वार्धक्य11,12लाती है । इस तरह के SOD1 के रूप में ROS-सफ़ाई एंजाइमों के निषेध, भी समयपूर्व वार्धक्य13का कारण बनता है । इसके विपरीत, कम परिवेश ऑक्सीजन की स्थिति और बढ़ती ROS सफाई वार्धक्य10,14,15की शुरुआत देरी । इन परिणामों निस्संदेह संकेत मिलता है कि ROS महत्वपूर्ण मध्यस्थों या सेलुलर वार्धक्य प्रेरण के निर्धारक हैं । हालांकि, सेलुलर वार्धक्य की प्रेरण में कैसे ROS योगदान देते हैं और सेलुलर वार्धक्य के दौरान ROS स्तरों को कैसे ऊंचा किया जाता है और जांच की आवश्यकता होती है ।
हाल के अध्ययनों से पता चला है कि वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं एक SASP16,17के माध्यम से पड़ोसी कोशिकाओं और ऊतकों पर शक्तिशाली paracrine गतिविधियों है । ऊतक वृद्ध में, वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं प्रफलन कोशिकाओं के एक स्वायत्त कमी के अलावा SASP के माध्यम से कई रास्ते के माध्यम से उम्र से संबंधित ऊतक शिथिलताओं को बढ़ावा देने के. विभिन्न भड़काऊ कारकों, जैसे il-6, il-8, TGFβ, और मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs), वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं द्वारा स्रावित, ऊतक homeostasis की हानि के माध्यम से उम्र से संबंधित ऊतक रोग, ऊतक वास्तुकला के विनाश के कारण, पड़ोसी कोशिकाओं के वार्धक्य, और बाँझ सूजन18,19. हालांकि, SASPs जैविक संदर्भ के आधार पर लाभकारी प्रभाव हो सकता है । इसके अलावा, SASPs की heterogenetic नेचर वृद्ध होनेवाला सेल टाइप और सेल स्टेज पर निर्भर करती है, आगे रिसर्च की जरूरत पर बल देते हुए19।
यहाँ, हम OIS के दौरान intracellular ROS स्तर का आकलन करने के लिए तेजी से और संवेदनशील cytometry आधारित तकनीक का वर्णन. इसके अलावा, मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) और एलिसा का उपयोग कर SASP कारकों के विश्लेषण के लिए तरीके पेश कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हमने एच-रास-प्रेरित वार्धक्य में वाई-३८ सामान्य मानव fibroblasts के दौरान intracellular ROS स्तरों की निगरानी के लिए विधियाँ प्रस्तुत की हैं. लाइव कोशिकाओं में Intracellular ROS स्तरों को मात्रात्मक सेल का उपयोग करके मापा जा ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (2015R1D1A1A01060839) (यंग येयून किम) और कोरिया सरकार (MSIT) (सं. 2016R1A2B2008887, सं द्वारा वित्त पोषित एनआरएफ) अनुदान के एक राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । 2016R1A5A2007009) (Jeanho को यूं) ।
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
References
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