Una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén
Summary
ROS intracelular se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la inducción de senescencia celular. Aquí, describimos un análisis sensible para cuantificar los niveles ROS durante la senescencia celular. También ofrecemos protocolos para evaluar el fenotipo secretor asociados a senescencia, que supuestamente contribuye a diferentes disfunciones relacionadas con la edad.
Abstract
Senescencia celular se ha considerado un estado de detención del crecimiento irreversible sobre agotamiento de la capacidad proliferativa o la exposición a tensiones diferentes. Estudios recientes han ampliado el papel de la senescencia celular a varios procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo, la cicatrización de heridas, vigilancia inmune y la disfunción relacionada con la edad del tejido. Aunque la detención del ciclo celular es una característica crítica de senescencia celular, una producción de aumento intracelular de oxígeno reactivo (ROS) las especies también se ha demostrado que juegan un papel importante en la inducción de senescencia celular. Además, estudios recientes revelaron que las células senescentes exhiben actividades potente paracrina sobre vecinos células y tejidos a través de un fenotipo secretorio asociada a la senescencia (spas). Fuerte aumento de interés sobre estrategias terapéuticas contra la senescencia celular hace hincapié en la necesidad de un entendimiento preciso de los mecanismos de la senescencia, incluyendo ROS intracelular y el SASP. Aquí, describimos protocolos para evaluar cuantitativamente los niveles ROS intracelulares durante la senescencia celular inducida por el H-Ras utilizando colorante fluorescente sensible al ROS y citometría de flujo. Además, presentamos las técnicas sensibles para el análisis de la inducción de la expresión del mRNA y la secreción de factores de spas. Estos protocolos pueden aplicarse a diversos modelos de senescencia celular.
Introduction
Más de 50 años, Hayflick y Moorhead revelaron que las células normales entren la detención de crecimiento irreversible sobre el agotamiento de su potencial proliferativo después de un cierto número de divisiones celulares1. Este fenómeno se conoce como senescencia replicativa y se cree que correlaciona fuertemente con la envejecimiento2. Aunque la erosión progresiva de los telómeros es considerada una de las principales causas de la senescencia replicativa, varias tensiones celulares, tales como daño del ADN, activación oncogénica y estrés oxidativo, se han divulgado para inducir a otro tipo de senescencia celular se llama “envejecimiento prematuro” o “senescencia inducida por estrés”. Curiosamente, senescencia prematura desempeña un papel supresor de tumor potente sobre la activación de oncogenes como H-Ras y BRAF. Estudios de modelos de ratón y de tejidos humanos han producido evidencia que eran predominante presentes en las lesiones premalignas donde oncogénica Ras y BRAF se activan pero fueron disminuidos en cánceres malignos que se convirtió de biomarcadores de la senescencia celular Estas lesiones3,4,5. Más allá de su papel en el envejecimiento y la supresión tumoral, senescencia celular se ha demostrado en estudios anteriores para jugar un papel en varios procesos fisiológicos, incluyendo la cicatrización de heridas, reparación de tejidos, vigilancia inmune y desarrollo embrionario6.
Aunque la detención de crecimiento ha sido estudiada extensivamente como un sello de senescencia celular7, un importante cuerpo de evidencia sugiere que esa especie intracelular de oxígeno reactivo (ROS) también contribuye a la senescencia celular8. La elevación de los niveles ROS durante varios tipos de senescencia celular, senescencia replicativa como senectud oncogene-inducida (OIS), originalmente se informó hace décadas9,10. Más directamente, el tratamiento exógeno con una dosis subletal de H2O2 induce senescencia11,12. La inhibición de enzimas barrido ROS como SOD1, también causa senescencia prematura13. En contraste, bajo condiciones de oxígeno ambiente y el aumento de retardo barrido ROS el inicio de la senescencia10,14,15. Sin duda, estos resultados indican que los ROS son mediadores importantes o determinantes de la inducción de senescencia celular. Sin embargo, cómo ROS contribuyen a la inducción de senescencia celular y cómo se elevan los niveles ROS durante la senescencia celular requieren una investigación adicional.
Estudios recientes han revelado que las células senescentes tienen actividades paracrinas potente sobre vecinos células y tejidos a través de una spas16,17. En el tejido envejecido, las células senescentes promoción disfunciones relacionadas con la edad del tejido mediante muchas vías a través de spas además de una disminución Autónoma de las células proliferativas. Factores proinflamatorios como la IL-6, IL-8, TGFβ y metaloproteinasas de matriz (MMPs), secretadas por las células senescentes, causan disfunciones relacionadas con la edad del tejido a través de la alteración de la homeostasis del tejido, destrucción de la arquitectura del tejido, senescencia de las células vecinas e inflamación estéril18,19. Sin embargo, SASPs puede tener efectos beneficiosos dependiendo el contexto biológico. Además, la naturaleza heterogenetic del SASPs depende del tipo de células senescentes y la etapa de la célula, haciendo hincapié en la necesidad de más investigación19.
Aquí, describimos técnicas basadas en citometría rápidos y sensibles para evaluar los niveles ROS intracelulares durante infecciones oportunistas. Además, se introducen métodos para el análisis de los factores de spas mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qPCR) y ELISA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos presentado para el monitoreo de los niveles ROS intracelulares durante la senescencia inducida por el H-Ras en fibroblastos humanos normales WI-38. Niveles ROS intracelulares en células vivas pueden medirse cuantitativamente utilizando el reactivo permeable a la célula DCF-DA y citometría de flujo. Absorción celular, DCF-DA es desacetilado por esterasas intracelulares y, posteriormente, oxidado por ROS para formar altamente fluorescente 2′, 7′-Diclorofluoresceína (DCF). La fluorescencia DCF puede detect…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una beca de la Fundación Nacional de investigación de Corea (2015R1D1A1A01060839) (a Young Yeon Kim) y por una beca de la National Research Foundation de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea (MSIT) (no. 2016R1A2B2008887 no. 2016R1A5A2007009) (a Jeanho Yun).
Materials
| REAGENTS | |||
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| BOSC 23 | ATCC | CRL-11269 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicillin/streptomycin | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclone | SH30013.02 | |
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| pBabe puro-H-RasV12 | Addgene | 1768 | |
| pGAG/pol | Addgene | 14887 | |
| pVSVG | Addgene | 1733 | |
| Turbofect | Thermo Fisher Scientific | R0531 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferrocyanide | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| potassium ferricyanide | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| trypsin-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| DCF-DA | Sigma-Aldrich | D6883 | 10 mM |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| MMLV Reverse transcriptase | Promega | M1701 | |
| SYBR Green PCR master 2X mix | Takara | PR820A | |
| Random Primer | Promega | C118A | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Human IL-6 ELISA assay | PeproTech | #900-TM16 | |
| Human IL-8 ELISA assay | PeproTech | #900_TM18 | |
| EQUIPMENTS | |||
| 0.45 μm syringe filter | sartorius | 16555 | |
| Parafilm | BEMIS | PM-996 | |
| Microscope | NIKON | TS100 | |
| Flow cytometer | BD Bioscience | LSR Fortessa | |
| Amicon Ultra-4ml | Merk Millipore | UFC800324 | |
| NanoDrop spectrophotometer | BioDrop | 80-3006-61 | |
| Real-time PCR System | Applied Biosystems | ABI Prism 7500 | |
| ELISA Reader | Molecular Devices | EMax microplate reader |
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