조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링
Summary
마이크로 RNAs (miRNAs) 메신저 RNAs (mRNAs)의 post-transcriptional 레 귤 레이 터로 봉사 하는 짧고 높은 동종 RNA 시퀀스입니다. 현재 미르 탐지 방법 감도 특이성에서 변화 한다. 우리는 현장에서 교 잡 및 마우스 심장 조직 섹션에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining를 결합 하는 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
마이크로 RNAs (miRNAs) 단일 가닥 RNA 사본 메신저 RNAs (mRNAs) 바인딩할 및 그들의 번역을 억제 또는 그들의 저하를 촉진 하는. 날짜 하려면, miRNAs 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검색 방법에 대 한 필요성을 의미 했다 생물학 및 질병 과정의 많은 수에 연루 되었습니다. 여기, 우리 digoxigenin 분류 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브 기반 미르 검색, 마우스 심장 섹션에 단백질 immunostaining와 함께 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 현장에서 교 잡 기술을 미르-182 식 제어 및 심장 비 대 쥐에서 심장 섹션에서을 식별 하는 프로브를 사용 하 여 수행. 다음, 우리는 공동 cardiomyocyte 셀 미르-182 지역화를 동일한 섹션에 심장 분 T (cTnT) 단백질에 대 한 immunostaining를 수행 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 통해 미르-182 기반 색도계 분석 결과, 및 형광 성 얼룩 통해 cTnT 감지할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 모든 miRNA LNA 발굴 표시 된 프로브를 통해 관심의 표현 및 마우스 심장 조직 섹션에 관련 된 단백질 표정 감지 하 사용할 수 있습니다.
Introduction
마이크로 RNAs (miRNAs)는 짧은 (18-25의 뉴클레오티드), 단일 가닥, noncoding RNAs는 메신저 RNA (mRNA) 번역 억제 및 홍보 mRNA 저하 여 post-transcriptional 수준에서 유전자 발현의 부정적인 레 귤 레이 터 기능 1. miRNAs는 introns 또는 코딩의 exons에서 복사할 수 또는 noncoding 유전자와 전조 miRNAs (pre-miRNAs), 70 뉴클레오티드2의 짧은 줄기 루프 구조를 DROSHA에 의해 핵에서 죽 습. 세포질 다음 내보내기, 사전 miRNAs 더 성숙한 miRNAs는 18-25의 뉴클레오티드3,4로 DICER에 의해 처리 됩니다. 그 후, RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC) 통합이 miRNAs 단일 가닥 RNAs로 그들의 식3,5 억제 하는 3′ 되지 않은 지역 (3′-UTR) 그들의 표적 mRNAs의 바인딩을 수 있는 .
그들은 처음으로 확인 했다, 이후 지난 3 년간 내 miRNAs가 유전자 발현, 그 자신의 식 레벨은 긴밀 하 게 제어6의 마스터 레 귤 레이 터 등장 했습니다. 장기 개발7,,89,10,11,12, 항상성13,14의 유지 보수에에서 miRNAs에 대 한 역할 설명 되었습니다. , 질병 컨텍스트 신경15,,1617,18,19, 심혈 관20를 포함 하는 자기 면역 조건21 뿐만 아니라 ,22, 암23,24, 등25. MiRNA 식 패턴의 관련성에 대 한 증가 감사 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검출 방법에 대 한 필요성을 게 앞으로 가져왔다. 이러한 방법 등이 실시간 PCR, microarrays, 북부에 게 더 럽 히기, 제자리에서 교 잡, 사실은 미르 성적표는 짧은 구성 주로 감도, 특이성, 및 양적 발전에 따라 고 매우 일치 순서6.
우리는 최근 미르-182 심근 비 대26, 높은 hemodynamic 요구27,28응답에서 심장의 구조적 적응을 설명 하는 조건 개발에 대 한 중요 한 역할을 했다. 심장 비 대 maladaptive 개장29와 관련 된 경우 심장 마비, 회계 모든 죽음의 8.5%에 기인 심장 혈관 상태에 대 한 위험 증가에 지도할 수 있는 심근 질량에 있는 증가 의해 특징입니다. 질병30.
우리가 현장에서 교 잡은 digoxigenin 표시 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브와 결합 마우스 심장 조직 단면도에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining에 우리의 프로토콜을 설명 하는 여기, 우리의 심장 비 대의 모델입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNA 사본 검출 감도, 특이성 및 양적 힘에서 변화 하는 다른 기술을 통해 얻을 수 있습니다. 여기, 우리 미르 교 잡 제자리에 immunostaining와의 커플링을 보여 같은 심장 섹션에 미르와 단백질 분자의 식 레벨의 동시 평가 허용 하는 프로토콜을 설명 하 고. 우리는 먼저 파라핀 포함 심장 섹션에 제자리에서 교 잡 파 표시 된 LNA 미르 프로브를 수행 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 아타 나 시오 스 Papangelis, 원고에 대 한 중요 한 의견에 대 한 감사 하 고 싶습니다. FM은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC;에 의해 지원 BB/M009424/1). IP는 미국 심장 협회 과학자 개발 그랜트 (17SDG33060002)에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
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