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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Live Cell Imaging del TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro e In Vivo utilizzando un sistema di Reporter dell'Adenovirus

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging di cellule vive di attività di segnalazione di TGF-β/Smad3 utilizzando un sistema di reporter dell'adenovirus. Questo sistema tiene traccia di attività trascrizionale in tempo reale e può essere applicato a entrambi singole cellule in vitro e nell'animale vivomodelli.

Abstract

Trasformando la segnalazione di fattore di crescita β (TGF-β) regola molte funzioni importanti richieste per l'omeostasi cellulare e si trova comunemente sovraespresso in molte malattie, compreso il cancro. TGF-β è fortemente implicata nella metastasi durante la progressione di cancro fase tarda, attivando un sottoinsieme delle cellule del tumore di migratori e invasivo. Attuali metodi per l'analisi dei percorsi di segnalazione concentrano su modelli di endpoint, che spesso tentano di misurare segnalazione post-hoc dell'evento biologico e non riflettono la natura progressiva della malattia. Qui, dimostriamo un romanzo dell'adenovirus reporter sistema specifico per la via di segnalazione di TGF-β/Smad3 che può rilevare l'attivazione trascrizionale in cellule vive. Utilizzando un reporter di Annuncio-CAGA12-Td-Tom , possiamo ottenere un tasso di infezione del 100% delle cellule MDA-MB-231 entro 24 h in vitro. L'uso di un reporter fluorescente permette per l'imaging delle cellule vive sola in tempo reale con identificazione diretta delle cellule trascrizionalmente attive. Stimolazione delle cellule infettate con TGF-β Visualizza solo un sottoinsieme delle cellule che sono trascrizionalmente attivi e coinvolti in funzioni biologiche specifiche. Questo approccio permette elevata specificità e sensibilità a livello di singola cellula per migliorare la comprensione delle funzioni biologiche legate alla TGF-β segnalazione in vitro. Smad3 attività trascrizionale può anche essere segnalato in vivo in tempo reale attraverso l'applicazione di un annuncio-CAGA12- Luc reporter. Annuncio-CAGA12- Luc può essere misurata nello stesso modo come linee cellulari tradizionali stabilmente trasfettate luciferasi. Smad3 attività trascrizionale di cellule impiantate in vivo può essere analizzata attraverso l'imaging convenzionale IVIS e monitorati dal vivo durante la progressione tumorale, fornendo una visione unica delle dinamiche del pathway di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo descrive un sistema di consegna reporter vantaggioso permettendo per rapido ad alta produttività imaging delle vie di segnalazione delle cellule dal vivo sia in vitro che in vivo. Questo metodo può essere espansa a una gamma di analisi di immagine basata e presenta come un approccio sensibile e riproducibile per biologia di base e sviluppo terapeutico.

Introduction

Fattore di crescita trasformante β (TGF-β) è una citochina essenziale implicata nello sviluppo umano che segnala attraverso un heterodimeric complesso composto di tipo II e tipo I recettori1. Associazione al tipo di recettore II risultati nel reclutamento e fosforilazione di tipo ricevitore, che a sua volta fosforila a valle Smad2/3 proteine2,3. Questi attivati Smad2/3 proteine legano al Smad4, formando un complesso che trasloca nel nucleo e regola gene trascrizione4. Condizioni omeostatiche TGF-β/Smad signaling è strettamente regolato; Tuttavia, in molte malattie, la via di segnalazione è liberalizzata e spesso sovraespresso leader alla progressione di malattia5,6,7. Studi recenti hanno dimostrato che la risposta cellulare a TGF-β è eterogenea e sottopopolazioni di cellule attive di TGF-β/Smad sono responsabili di funzione biologica in un modo dipendente dal tempo8,9. Analisi cellulare comune di segnalazione di TGF-β/Smad prevede l'utilizzo di analisi di endpoint fisso che offrono solo una panoramica dell'attività cellulare e spesso quantificare il medio di effetto di TGF-β/Smad10. Questi metodi, tuttavia, non possono rappresentare con precisione i comportamenti molecolari di segnalazione di TGF-β/Smad nello stato fisiologico durante la progressione di malattia. Analisi basata su immagine di cellule vive, che cattura la dinamica dei processi biologici e cellulari con entrambi una comprensione spaziale e temporale.

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un metodo di alto-rendimento sensibile per l'imaging di cellule vive di TGF-β/Smad segnalazione utilizzando reagenti a base dell'adenovirus. Qui, abbiamo infettato la linea cellulare di cancro al seno umane MDA-MB-231 con un adenovirus che esprimono la sequenza di binding motif Smad3 CAGA e luciferasi (Luc) o gene reporter Td-pomodoro (Td-Tom). Sistemi reporter adenoviral forniscono un metodo rapido ed economico per introduzione di plasmide che può provocare un tasso di infezione del 100% in linee cellulari del cancro. Sistemi reporter adenoviral sono inoltre stati applicati con successo a linee cellulari che sono difficili a transfect con convenzionale plasmide11. In questo protocollo descriveremo un processo riproducibile e non invadente per ottenere immagini di cellule vive del pathway di segnalazione del TGFβ/Smad sia in vivo che in vitro.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Università di Melbourne animale comitato etico.

Nota: Il protocollo di sequenza, di costruzione e di generazione per il adenoviral file vettoriale pAnnuncio-CMV-Td-Tom, pAnnuncio-CMV-GFP e pAnnuncio-CAGA12- Luc/Td-Tom sono stati descritti in precedenza11,12, 13. Tutti i vettori sono disponibili in commercio.

1. virus titolo determinazione utilizzando 50% coltura tissulare Dose infettiva (TCID50)

  1. Preparare 1 x 106 cellule HEK293A in 10 mL di DMEM + 10% FBS media.
  2. Semi di 100 µ l di sospensione cellulare in tutti i pozzetti di una piastra di coltura cellulare di 96 pozzetti a fondo piatto.
  3. Preparare 1 mL di una diluizione di 1: 100 di stock di virus in terreno completo. Aggiungere 11 µ l di virus diluito in ciascun pozzetto della colonna 1.
  4. Effettuare diluizioni seriali 10 volte direttamente nella piastra ben 96 mescolando 11 µ l di virus diluito con 100 µ l di sospensione cellulare fino ad una diluizione finale di 1 x1012 è raggiunto. Anche se le cellule sono non aderente in questa fase, il numero delle cellule trasferite tra pozzi rimane costante.
  5. 11 µ l di ciascuna diluizione in ogni colonna a partire con la più alta diluizione di 104. Sostituire i puntali per pipette con ogni diluizione per limitare l'incrocio delle particelle virali.
  6. Aggiungere 11 µ l di antivirus completa per i media alla colonna 12 come controllo negativo.
  7. Incubare la piastra per 7-10 giorni a 37 ° C con 10% CO2.
  8. Utilizzando un microscopio, segnare il numero di pozzi in ogni colonna presenta i sintomi di effetti citopatici o citotossici. Si consideri un bene positivo se è presente alcun segno di infezione.
  9. Calcolare la frazione di pozzetti positivi per ogni diluizione utilizzando il Reed e Muench metodo statistico (1938)14.
  10. Calcola la distanza proporzionale (PD): (A-50)/(A-B), dove A è la risposta di percentuale superiore o uguale al 50% e B è la risposta di percentuale inferiore al 50%.
  11. Calcolare TCID50 utilizzando: 10X-PD, dove X è la diluizione dando una risposta supera al 50%.
  12. Calcolare il titolo virale da utilizzando il seguente: 0.69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL

2. adenovirus MOI determinazione

  1. Seme 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 cellule con 500 μL di DMEM terreni di coltura contenente 5% FBS in ciascun pozzetto di un 12 ben piatto (confluency di 35% delle cellule, 6 pozzi in totale).
  2. Calcolare i volumi di Annuncio-CMV-Td-Tom stock richiesto per 0, 250, 500 e 2500 e 5000 MOI utilizzando il seguente formula: MOI = (volume [µ l] x PFU/μL) / numero di cellule. Per Annuncio-CMV-Td-Tom con un titolo di 1 x 1010 (PFU/mL), i volumi dell'infezione del virus MOIs richiesti sono rispettivamente 0, 3,75, 7.5, 37.5 e 75 μL.
  3. Infettare le cellule con i volumi calcolati di Annuncio-CMV-Td-Tom nella sezione 2.2 pipettando direttamente stock virali nei pozzetti con accurata miscelazione.
  4. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.
  5. Rimuovere il supporto dai pozzetti e correggere immediatamente le celle con 500 μL di formalina al 10% per 5 min.
  6. La formalina da pozzi di aspirare e lavare i pozzetti con 500 μL di PBS una volta.
  7. Macchia di nucleo della cellula con 500 μL di soluzione di Hoechst per 5 min.
  8. Rimuovere la soluzione di Hoechst e lavare i pozzetti con 500 μL di PBS 3 volte.
  9. Immagine la proteina Td-pomodoro e nucleo cellulare segnale con 200 ingrandimenti su un microscopio a fluorescenza. Eccitare la proteina Td-pomodoro a 554 nm e il colorante Hoechst a 352 nm.
  10. Analizzare le immagini usando ImageJ per determinare il funzionamento che Moi necessaria per l'infezione di Td-pomodoro15100%.

3. dual-adenovirus trasduzione in streaming in singole cellule

  1. Seme 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 cellule con 500 μL di DMEM terreni di coltura contenente 5% FBS in ciascun pozzetto di un 12 ben piatto (confluency di 35% delle cellule, 2 pozzi in totale).
  2. Infettare le cellule con 75 μL di Annuncio-CMV-GFP (titolo = 5 x 109 PFU/mL) e 7,5 μL di Annuncio-CAGA12-Td-Tom (titolo = 5 x 1010 PFU/mL) per ottenere un 2.500 MOI, che può raggiungere 100% positività di infezione.
  3. Curare le cellule con o senza 0.25 μL di TGF-β per pozzetto (10 mg/mL in magazzino, 5 ng/μL come la concentrazione finale) immediatamente dopo l'infezione dell'adenovirus.
  4. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.
  5. Cellule vive di immagine con il microscopio di fluorescenza di contrasto di fase. Eccitare GFP a 470 nm e proteina di Td-pomodoro a 554 nm.
  6. Difficoltà cellule e macchia nucleo cellulare come descritto nella procedura 1.6 - 1.9.
  7. Immagine la proteina Td-pomodoro e Hoechst macchia usando un microscopio a fluorescenza. Eccitare il colorante Hoechst a 352 nm.
  8. Usando ImageJ, calcolare che la percentuale di GFP e Td-pomodoro positivo cellule15.

4. vivo cellula singola segnalazione in cicatrizzazione Assay

  1. Semi di 4-5 x 105 MDA-MB-231 cellule con 1 mL di terreni di coltura DMEM contenente 5% FBS in ciascun pozzetto di un 6 piastra ben (confluency di 50% delle cellule, 2 pozzi in totale).
  2. Infettare le cellule con 22,5 μL di Annuncio-CAGA12-Td-Tom (titolo = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.
  4. Gratta e Vinci due linee incrociate sul livello delle cellule di ciascun pozzetto usando una pipetta P200.
  5. Rimuovere i vecchi media da pozzi e sostituire con 2 mL di fresco 5% FBS media con o senza 0,5 μL di TGF-β per pozzetto (10 mg/mL in magazzino, 5 ng/μL come concentrazione finale).
  6. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 5 min e prendere le immagini delle aree selezionate ferita usando 100 X ingrandimento su un microscopio a contrasto di fase.
  7. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.
  8. Prendere immagini della chiusura della ferita allo stesso zone come prima.
  9. Fissare le cellule, macchia nucleo cellulare come descritto nella procedura 1.6 - 1.9 e visualizzare il segnale del Td-pomodoro nella zona ferita e non ferita usando 200 X ingrandimento su un microscopio a fluorescenza.
  10. Quantificare la percentuale di cellule positive Td-pomodoro nell'area non-ferita usando ImageJ software15e ferita.

5. in Vitro Luciferase Assay

  1. Preparare una sospensione di cellule di 3-5 x 104 MDA-MB-231 cellule in 1 mL di terreno DMEM contenente il 5% di FBS.
  2. Infettare sospensione cellulare con 2,5 µ l di annuncio-CAGA12- Luc (titolo = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Seme le cellule infette in un 96 piastra bene alle 3.000 cellule/100 µ l/pozzetto.
  4. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.
  5. Rimuovere vecchi media da pozzi e sostituire con 100 µ l di fresco media 5% FBS con o senza 0.1 μL di TGF-β per pozzetto (1 mg/mL in magazzino, 1 ng/μL come la concentrazione finale) e in presenza o assenza di 0,17 μL di inibitore di TGF-β per pozzetto (7 mg/mL in magazzino 12 ng/μL come concentrazione finale) (una nuova proteina legante di trappola di TGF-β, Chen et al., inedito lavoro).
  6. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 ° C con 10% CO2 per 24 h.
  7. Scongelare il substrato di sistema luciferase assay e preparazione del 1 x cella cultura reagente di lisi in doppia acqua distillata (DDW).
  8. Rimuovere il supporto da 96 pozzetti e lisare pozzi con 50 μL 1 x cella cultura di tampone di lisi sul ghiaccio con un agitatore orbitale con agitazione delicata per 30 min.
  9. Trasferire 30 μL di lisato da ogni pozzetto in una piastra di luciferasi opaco e consentire la piastra a temperatura ambiente.
  10. Il luminometro, creare un nuovo protocollo. Selezionare per 1 iniettore con misurazioni prima e dopo l'iniezione. Impostare misure prima dell'iniezione a 1 s per ritardo nella misura e Tempo d'integrazione. Per impostare il Volume di iniezione dopo la misurazione di iniezione, 40 µ l con un ritardo nella misura di 1 s dopo l'iniezione e 5 s Tempo di integrazione. Confermare le impostazioni premendo il pulsante OK.
  11. Inserire il tubo iniettore DDW e fare clic sul pulsante iniettore 1 sotto le Prime impostazioni per pulire il tubo iniettore prima dell'uso. Successivamente rimuovere il tubo iniettore dal DDW e posto in aria seguita da ulteriori due numeri primi di iniettore 1 per svuotare tutta la soluzione dal tubo. Inserire il tubo iniettore in substrato di Firefly e ancora Prime due volte per preparare il substrato.
  12. Posizionare la piastra di luciferasi opaco con i campioni nel luminometro e selezionare le Opzioni del software. Evidenziare i pozzi di interesse e fare clic su applica. Premere il tasto Start per misurare il segnale luciferasi.
  13. Una volta completate misure, rimuovere e sciacquare la piastra con acqua. Recuperare qualsiasi substrato rimanente nel tubo iniettore inserendo il tubo in aria e primo iniettore 1 indietro nel tubo di substrato di firefly. Inserire il tubo iniettore DDW ed eseguire ulteriori due numeri primi per pulire il tubo iniettore di qualsiasi substrato rimanente.

6. cella preparazione per Live segnalazione Imaging In Vivo

  1. 48 ore prima dell'impianto del tumore, semi 2-3 x 106 MDA-MB-231 cellule in boccette di 175 cm2 (10 boccette in totale). Coltura di cellule in 20 mL di terreno DMEM contenente 5% FBS a 37 ° C, 10% CO2.
  2. 24 h dopo, aggiungere 300 μL di annuncio-CAGA12- Luc (titolo = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) in ciascuna beuta. Mantenere le cellule in coltura per altre 24 ore.
  3. Il giorno dell'impianto, è necessario rimuovere i vecchi media e lavare le cellule dell'adenovirus infettato una volta con 20 mL di PBS, pH 7.4. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,05% nella beuta e agitare il matraccio leggermente per consentire tripsina coprire tutta la superficie del pallone. Posizionare il pallone nell'incubatore 37 ° C, 10% CO2 per 3 min.
  4. Placare la tripsina aggiungendo 8 mL di terreno DMEM FBS-contenenti in palloni. Trasferire tutte le sospensioni di cellule in una bottiglia di vetro del reagente.
  5. Contare il numero di cellulare utilizzando un emocitometro e trasferire 4.8 x 107 cellule in due provette da centrifuga 50 ml.
  6. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min a RT per rimuovere tripsina e risospendere le cellule in 720 di media FBS-DMEM fresco.
  7. Trasferire le sospensioni delle cellule in una provetta sterile 5 mL e aggiungere 160 μL Matrigel (10% totale matrigel sospensione).
  8. Mantenere le cellule su ghiaccio fino all'impianto.

7. l'impianto ortotopico

  1. Pesare 12 topi SCID e allocare in modo casuale i topi nei gruppi di controllo e trattamento (6 topi/gruppo).
  2. Eseguire l'impianto in un sterile bio-armadietto per mantenere un ambiente sterile. Anestetizzare il mouse usando isoflurano 2,5-4,5% con un tasso di flusso di ossigeno di 1 L/min. Posizionare il mouse su una piastra di calore e versare una goccia di lubrificante unguento oculare su entrambi gli occhi per evitare danni alla cornea. Difficoltà il mouse per il termoforo in posizione supina, mentre mantenere l'anestesia inserendo il muso in un cono di naso collegato per l'isoflurano.
  3. Confermano il successo dell'anestesia dalla mancanza di reazione alla punta pizzico. Ridurre isoflurano a una dose di mantenimento di 1,5-2,5% con 1 L/min di ossigeno per il promemoria dell'impianto.
  4. Pulire la pelle dal capezzolo quarto su entrambi i lati alla linea mediana utilizzando il tampone di cotone immerso in 80% di etanolo.
  5. Trovare i 4th cuscinetto grasso mammario mediante palpazione e spremere il cuscinetto di grasso per esporre ulteriormente il tessuto.
  6. Miscelare la sospensione cellulare ben pipettando su e giù. Delicatamente aspirare 50 µ l di miscela delle cellule in una siringa da insulina 27g e iniettare nel cuscinetto grasso mammario su entrambi i lati del mouse.
  7. Confermare un'iniezione di successo di sensazione per il gonfiamento del rilievo grasso. Rilasciare delicatamente il cuscinetto di grasso e posizionare il mouse indietro nella gabbia.
  8. Lasciare le gabbie sul termoforo per almeno 30 min consentire i topi acquisire coscienza e quindi posizionare le gabbie torna in camera della holding per 3 giorni.

8. IVIS Imaging

  1. Aprire il software di Immagine vivente .
  2. Inizializzare il sistema IVIS facendo clic sul pulsante Inizializzare IVIS sistema sul pannello di controllo. Attendere fino a quando il segno di temperatura diventa verde.
  3. Selezionare la modalità di Imaging di luminescenti sul pannello di controllo.
  4. Accendere isoflurano anestesia al sistema IVIS e camera.
  5. Anestetizzare i topi utilizzando isoflurano 2.5-4.5% con 1 L/min di ossigeno. Una volta anestetizzati, impostare isoflurano 1,5-2,5% per la manutenzione. Iniettare 150 mg/kg di peso corporeo di D-luciferina in topi tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.).
  6. Trasferire immediatamente i topi nel sistema IVIS, metterli sulla piattaforma di imaging temperatura controllata e posto loro naso nel cono di naso.
  7. Fare clic sul pulsante Sequenza installazione su pannello di controllo e selezionare Medio Binning.
  8. Impostare il tempo di esposizione imaging come segue: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s e 120 s. Start imaging circa 3 min dopo l'iniezione di luciferina e continuano a immagine fino a quando il segnale inizia a calare (normalmente questo richiederà circa 20 min).
  9. Rimuovere i topi IVIS mantenendo isoflurano anestetico attraverso un cono di naso e curare i topi con 50 µ l PBS o inibitore segnalazione di TGF-β 50 µ l (50 μg/tumore) via l'iniezione intra-tumorale.
  10. Rimettere i topi in gabbia e li lasci sul termoforo per almeno 30 min. Quindi posizionare la gabbia torna in camera della holding.
  11. Ripetere IVIS procedura di imaging, come descritto in precedenza il giorno dopo il trattamento.

9. analisi dei dati

  1. Aprire file salvati nel Living immagine software.
  2. Trovare le informazioni di immagine utilizzando vista | Informazioni sull'immagine.
  3. Selezionare foto scattate in un momento simile con lo stesso tempo di esposizione. Caricare le foto come un gruppo.
  4. Deselezionare la casella individuale nella Regolazione di immagine per normalizzare l'intensità.
  5. Selezionare la modalità di Photon per analizzare l'intensità. Quantificare l'intensità del segnale selezionando il pulsante Area di interesse (ROI) in Strumenti di ROI.
  6. Trascinate il cerchio ROI per la regione che contiene il segnale bioluminescente e fare clic sul pulsante di misura per acquisire l'intensità del segnale.

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Representative Results

Vivere la singola cella imaging in vitro

Per valutare con precisione l'attivazione di segnalazione di TGF-β/Smad in singole cellule utilizzando reagenti dell'adenovirus basato, è importante determinare innanzitutto la molteplicità ottimale di infezione (MOI) per ogni linea cellulare. Il MOI ottimo è determinato quando il 100% delle cellule sono positivi per l'infezione adenoviral con gli effetti citopatici o citotossici non presenti. Per determinare questo, abbiamo usato un reporter di Annuncio-CMV-Td-Tom costitutivamente attivo che ha agito come un marcatore di infezione positivo. La percentuale di cellule dell'adenovirus infettata è stata aumentata in modo dipendente da 0 a 5.000 MOI MOI. A 2.500 MOI, abbiamo osservato 100% Td-Tom l'espressione in cellule MDA-MB-231 (Figura 1A, 1B). Intensità di pixel/cellulare aumentato anche con MOI, fornendo una maggiore sensibilità e rilevamento di transcriptional output (Figura 1). Pertanto, un lavoro MOI di 2.500 è stata utilizzata per eseguire un'infezione doppia dove le cellule sono state infettate con Annuncio-CMV-GFP (servito come controllo positivo per l'infezione delle cellule) e Annuncio-CAGA12-Td-Tom contemporaneamente. Celluli ha presentato diversi livelli di espressione di Td-Tom che indicano eterogeneo attivazione della trascrizione di TGF-β/Smad3 attraverso cellule in cellule sia dal vivere che fisse. (Figura 2A, 2B). 100% delle cellule MDA-MB-231 ha presentate con espressione di GFP, mentre solo circa 26% delle cellule visualizzato attività trascrizionale di TGF-β/Smad3 rilevabile 24 h dopo stimolazione TGF-β, rispetto alla positività di 0% senza trattamento di TGF-β (Figura 2). Per utilizzare il reagente dell'adenovirus basata per indagare l'attività trascrizionale di TGF-β/Smad3 durante i processi biologici, cellule MDA-MB-231 sono state infettate con Annuncio-CAGA12-Td-Tom a 2500 MOI e sottoposti ad un dosaggio di cicatrizzazione. Infetta le cellule MDA-MB-231 ha esibito comportamento normale migrazione e cellule trattate con 5 ng/mL di TGF-β ha mostrato la chiusura arrotolata migliorata rispetto ai non-TGF-β cellule trattate (Figura 3A). In particolare, circa il 62% cellule nell'area della ferita ha presentato attività trascrizionale positiva di TGF-β/Smad3, che è significativamente superiore a quella osservata nell'area non-ferita (32%) dopo il trattamento di TGF-β (Figura3B). Come tale, i reagenti basati su adenovirus convalidato loro applicazione per l'imaging della via di segnalazione di TGF-β in diretta singola cellula in vitro.

Vivere il TGF-β segnalazione imaging in vivo

La sensibilità del reporter annuncio-CAGA12- Luc è stato prima testato in vitro in risposta a stimolazione TGF-β e la presenza di un inibitore di TGF-β. Quando cellule MDA-MB-231 infette sono state stimolate con 1 ng/mL di TGF-β, attività del reporter di luciferase aumentata 1,200-fold rispetto ai livelli basali di MDA-MB-231 non trattati. Questa risposta notevolmente è stata bloccata da 12 µ g/mL dell'inibitore di TGF-β (Figura 4A). Il annuncio-CAGA12- Luc reagente è stato successivamente testato in un modello animale di seno tumore orthotopic l'impianto. Sia il controllo e l'inibitore di TGF-β trattati dimostrata attività di simili reporter di luciferase gruppi prima del trattamento. Tuttavia, per il gruppo di controllo, il segnale di luciferasi non è cambiato dopo il trattamento di PBS, mentre, i topi trattati con l'inibitore di TGF-β ha mostrato la riduzione di circa 3 volte segnale (Figura 4B, 4C). Collettivamente, questi risultati dimostrano il potenziale per il monitoraggio di TGF-β segnalazione attività in vivo senza la necessità del sacrificio animale dal vivo e in tempo reale.

Figure 1
Figura 1. Determinazione del MOI del reagente dell'adenovirus-base. Cellule MDA-MB-231 sono state infettate con Annuncio-CMV-Td-Tom presso diversi MOI e seminate in una piastra di 12 pozzi. 24 h dopo l'infezione, le cellule sono state fissate e colorate nucleare con Hoechst. (A) le immagini sono stato scattato di visualizzare cellule positive Td-Tom (rosse) e nucleo (blu) e quantificato di ImageJ. (B) cellule positive percentuale di Td-Tom. (C) Td-Tom pixel intensità/cella normalizzati allo sfondo. Queste cifre sono rappresentative di almeno 3 esperimenti indipendenti. I dati indicati sono mezzi di triplici copie ± SD. scala bar = 50 µm (200 X). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Imaging di singola cellula per infezione doppia. Cellule MDA-MB-231 erano duale infettato con CMV-annuncio-GFP e Annuncio-CAGA12-Td-Tom a MOI (2.500) e seminate in una piastra di 12 pozzi. 24h dopo l'infezione, le cellule sono state trattate con o senza 5 ng/mL di TGF-β. (A) 24 h dopo il trattamento, le cellule erano live imaging per visualizzare GFP positivo (verde) e Td-Tom positivo (rosso) delle cellule. Le cellule sono state quindi fissate e nucleare macchiato da Hoechst per quantificazione. (B) immagini sono state scattate a visualizzare GFP positivo (verde), Td-Tom positivo (rosse) cellule e nucleo (blu). (C) la GFP o Td-Tom cellule positive sono state quantificate da ImageJ ed è stata calcolata la percentuale di cellule positive. Queste cifre sono rappresentative di almeno 3 esperimenti indipendenti. I dati indicati sono mezzi di triplici copie ± SD. Statistical significato è stata determinata mediante test t di Student (* * * p ≤ 0.0001). Barra della scala = 50 µm (200 X). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Segnalazione di tensione delle cellule TGF-β promuove la migrazione cellulare. Cellule MDA-MB-231 sono state infettate con Annuncio-CAGA12-Td-Tom a MOI (2.500) e seminate su una piastra di 6 pozzi. 24 h dopo l'infezione, le cellule sono state graffiate utilizzando una punta di pipetta P200 per creare una ferita e mezzi sostituiti con o senza 5 ng/mL di TGF-β. Dopo altre 24 ore, le cellule sono state fissate e colorate nucleare con Hoechst per rappresentazione visiva. (A) fase di contrasto della chiusura della ferita, scala bar = 100 µm (100 X). (B) Td-Tom positivo (rosse) cellule e nucleo (blu). Barra della scala = 50 µm (200x) cellule positive (C) Td-Tom sono state quantificate da ImageJ ed è stata calcolata la percentuale di cellule positive. Queste cifre sono rappresentative di almeno 3 esperimenti indipendenti. I dati indicati sono mezzi di triplici copie ± SD. Statistical significato è stata determinata mediante test t di Student (* * * p ≤ 0.0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Nella figura 4. In vivo live imaging di segnalazione di TGF-β. (A) cellule MDA-MB-231 sono state infettate con annuncio-CAGA12- Luc e seminate nella piastra 96 pozzetti per 24 h. Successivamente, le cellule sono state trattate con o senza 1 ng/mL TGF-β in presenza o assenza di inibitore di TGF-β 12 µ g/mL durante la notte. L'attività luciferasica è stata misurata in base l'intero lisato cellulare. Attività di luciferase sono stati presentati come la piega di induzione normalizzato a nessun controllo di trattamento. I dati indicati sono mezzi di triplici copie ± SD. (B) MDA-MB-231 cellule sono state infettate con annuncio-CAGA12- Luc 24 h prima dell'impianto. Le cellule sono state impiantate nel cuscinetto grasso mammario su entrambi i lati di topi SCID. 72 h dopo, IVIS imaging è stata eseguita prima e dopo il trattamento di 24 h (PBS per gruppo di controllo) e 50 µ g/tumore TGF-β inibitore per gruppo di trattamento. Fotone (C) flusso è stata quantificata tramite software immagine vivente. I dati indicati sono mezzi di ciascun gruppo di trattamento (n = 12) ± SD. Statistical significato è stata determinata mediante test t di Student (* * p ≤ 0,01, * * * p ≤ 0.0001). p/s si riferisce a fotoni/s. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo sviluppato una tecnica per consentire per l'imaging in tempo reale di segnalazione di TGF-β/Smad3 in singole cellule vive. Utilizzando questo metodo novello, precedentemente abbiamo identificato una sottopopolazione di cellule con attività trascrizionale TGF-β/Smad3 dinamica che è stata associata con una maggiore invasione e migrazione8. Questo metodo migliora le analisi tradizionali per la segnalazione di TGF-β, quali macchie occidentali di fosforilazione Smad3 e TGF-β mirati di espressione genica, catturando l'eterogeneità di TGF-β/Smad3 segnalazione all'interno della popolazione del tumore ed evidenziando il importanza della singola cellula biologia. Inoltre, metodi alternativi di singola cellula imaging come traslocazione nucleare può essere che richiede tempo e costoso se eseguita cellule vivono e non possono sempre tradurre a gene trascrizione16,17. Mentre questi metodi sono importanti esaminare l'upstream vie di trasduzione del segnale, il sistema di reporter dell'adenovirus fornisce una prospettiva unica sulla segnalazione di TGF-β/Smad3 in singole cellule in relazione alla funzione biologica.

Significativamente, il nostro metodo fornisce un metodo sensibile e riproducibile per la rilevazione in vivo della via di segnalazione di TGF-β/Smad3 in tempo reale durante la progressione del tumore e il trattamento. Simile a tradizionale luciferasi stabile in vivo imaging, rilevamento di TGF-β/Smad3 segnalazione all'interno del mouse dipende il numero di celle e livello di attività di promotore18. Mentre il tessuto sottocutaneo fornisce poca interferenza per analisi, una maggiore profondità di cellule ridurrà la sensibilità di rilevamento del segnale. È possibile espandere il metodo per l'utilizzo in altri organi, come il polmone e dell'osso e di altri cancri; Tuttavia, ottimizzazione del segnale o ex vivo imaging è consigliabile raggiungere la sensibilità necessaria per il modello di cancro di interesse.

Un ulteriore vantaggio dell'utilizzo del sistema di reporter dell'adenovirus è che la sua applicazione è probabile che espandere all'analisi delle molteplici vie di segnalazione simultaneamente in cellule vive. In Figura 2A, abbiamo dimostrato che cellule MDA-MB-231 potrebbero essere trasdotte con 2 vettori separati dell'adenovirus, CMV-GFP e CAGA-TOM. Questo sistema di dual-infezione può essere ulteriormente ampliato per segnalare due diverse vie di segnalazione via sia proteine di fluorescenza reporter e giornalisti di luciferasi (utilizzando proteine di reporter luciferasi Firefly e Guassia). Il nostro laboratorio ha raggiunto simultanea di segnalazione delle vie di segnalazione BMP/Smad1 e TGF-β/Smad3 in una serie di linee cellulari di cancro dal vivo (dati non mostrati).

Sistemi reporter dell'adenovirus forniscono un metodo facile e conveniente per l'imaging di cellule vive del pathway di segnalazione di TGF-β/Smad sia in vitro che in vivo. Questo sistema ha diversi vantaggi rispetto altri sistemi comunemente usati reporter. In primo luogo, i vettori dell'adenovirus sono segnalati per avere tra la massima efficacia di trasduzione virale, che li rende un sistema ottimale per linee cellulari che sono difficili da trasdurre19,20,21,22. Inoltre con attuali progressi nelle tecnologie di virale, vettori 'smidollato' dell'adenovirus possono essere generati rimuovendo la maggior parte del genoma virale, permettendo per aumento di capacità di DNA23esogeno. Rispetto ai vettori non virali, l'adenovirus vettori rappresentano un'applicazione conveniente, rapida e facile per la trasduzione delle cellule che si traduce in maggiore consegna efficienza19,20,21 ,22.

Questo protocollo utilizza un sistema di espressione dell'adenovirus di seconda generazione, che è la replica-incompetente in cellule di mammiferi che non esprimono le proteine E1a ed E1b, minimizzando il rischio di biosicurezza24. Tuttavia, nonostante queste funzioni per la biosicurezza, adenovirus possono ancora particelle trasdurre cellule umane primarie con elevata efficacia25,26. US di biosicurezza di livello 2 e il contenimento dei vettori adenovirali è consigliato quando la manipolazione e lo smaltimento dell'adenovirus contaminati attrezzature. Amplificazione su larga scala dell'adenovirus in HEK293A cellule può causare una rara generazione di replica-competente dell'adenovirus "wild-type"27. Screening di PCR dovrebbe essere effettuato per identificare la contaminazione di selvaggio-tipo27.

Replica-incompetente dell'adenovirus vettori sono transitori nell'espressione e non si integrano con host DNA20,21. È consigliabile che lo sperimentatore identificare la stabilità nell'espressione della loro proteina reporter quando si utilizza il sistema di reporter dell'adenovirus per confermare la validità degli esperimenti a lungo termine. La data di espressione del vettore dell'adenovirus all'interno di una cella è proporzionale al tempo di divisione della cellula e MOI virale. Per garantire risultati riproducibili, è fondamentale che il titolo virale viene determinato con precisione per ogni batch virale. Inoltre, eccessivamente elevati volumi di adenovirus possono provocare effetti citotossici o citopatici ed è importante che un MOI ottimo viene empiricamente determinato per ogni cella foderata utilizzati per garantire i migliori risultati. Inoltre, uso in vivo di vettori dell'adenovirus può indurre risposte immunitarie; dove la risposta immunitaria non è l'osservazione principale dell'esperimento, gli animali immunocompromessi sono raccomandati20,21. Ulteriore controllo di qualità è necessario quando si utilizzano i vettori adenovirali alle risposte immunitarie di destinazione, anche se l'uso dell'adenovirus è stato convalidato come adiuvante al vaccino terapie28,29.

Il sistema di reporter dell'adenovirus può essere utilizzato su una vasta gamma di linee cellulari primarie e colta di divisione e divisione natura20,22. Utilizzando il sistema di reporter dell'adenovirus, abbiamo raggiunto 100% tassi di infezione in un certo numero di linee cellulari del cancro compreso il cervello, al seno, colorettale come bene primario del Mouse embriologica del fibroblasto (MEF) e canini epiteliali renali (MDCK) cellule. Inoltre, i vettori adenovirali possono essere ulteriormente modificati per aumentare l'affinità per i recettori specifici cellula-tipo, fornendo migliorato organo targeting ed efficacia per trasduzione30,31.

Applicazioni di questo metodo possono essere espansa per altre vie di segnalazione e cella host. I principali vantaggi del sistema reporter adenoviral includono l'efficacia di trasduzione a buon mercato, alta, la rapida messa a punto sperimentale e la mancanza di integrazione con host DNA21,32. Questo metodo può essere applicato a molti saggi di corrente e in vivo modelli, inclusi nella valutazione di nuove terapie mirate33. Speriamo che l'uso di questa tecnica sarà migliorare la nostra comprensione del rapporto tra segnalazione percorsi e processi biologici che portano a nuove scoperte biologiche e lo sviluppo di nuove terapie.

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Disclosures

Gli autori non segnalano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Health and Medical Research Consiglio (NHMRC) per H-JZ. TMBW è un destinatario di un premio post-laurea in Australia dal governo australiano e la borsa di studio Top-Up di Henderson Ann da Australian Rotary Health in partner con Rotary di Templestowe e Dine per una cura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

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References

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Ricerca sul cancro problema 137 TGF-β live cell imaging l'adenovirus segnalazione attivazione trascrizionale di seno cancro Smad3 cellulare
Live Cell Imaging del TGF-β/Smad3 Signaling Pathway <em>In Vitro</em> e <em>In Vivo</em> utilizzando un sistema di Reporter dell'Adenovirus
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Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

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