Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Live celle avbildning av den TGF-β/Smad3 signalnettverk Pathway In Vitro og i Vivo bruker en Adenovirus Reporter System

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for levende celle imaging TGF-β/Smad3 signalnettverk aktivitet ved hjelp av en adenovirus reporter system. Systemet sporer transcriptional aktivitet i sanntid og kan brukes til både enkeltceller i vitro og i levende dyrmodeller.

Abstract

Transformasjon av vekstfaktor β (TGF-β) signalering regulerer mange viktige funksjoner som kreves for mobilnettet homeostase og er vanligvis grunnlegge overexpressed i mange sykdommer, inkludert kreft. TGF-β er sterkt involvert i metastasering under sent stadium kreft progresjon, aktivere et delsett av trekkfugler og invasive kreftceller. Gjeldende metoder for signalering sti analyse fokuserer på sluttpunktet modeller, som ofte forsøker å måle signalnettverk innlegg-hoc av biologiske hendelsen og reflekterer ikke progressive natur sykdommen. Her viser vi en roman adenovirus reporter systemet bestemt for den TGF-β/Smad3 signalveien som kan oppdage transcriptional aktivisering i levende celler. Bruker en Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, kan vi oppnå en 100% infeksjon rate av MDA-MB-231 celler i 24 h i vitro. Bruk av fluorescerende reporter tillater avbilding av live enkeltceller i sanntid med direkte identifikasjon av transcriptionally aktive celler. Stimulering av infiserte celler med TGF-β viser bare et delsett av celler som er transcriptionally aktive og involverte i bestemte biologiske funksjoner. Denne tilnærmingen gir høy spesifisitet og følsomhet på en enkelt cellenivå å øke forståelsen av biologiske funksjoner knyttet til TGF-β signalnettverk i vitro. Smad3 transcriptional aktivitet kan også rapportert i vivo i sanntid gjennom bruk av en Ad-CAGA12- Luc reporter. Ad-CAGA12- Luc kan måles på samme måte som tradisjonelle stabilt transfekterte luciferase linjer. Smad3 transcriptional aktiviteten til cellene implantert i vivo kan analyseres gjennom konvensjonelle IVIS avbildning og overvåket live under svulst progresjon, gir unik innsikt i dynamikken i TGF-β signalveien. Våre protokollen beskriver en fordelaktig reporter leveringssystem muliggjør rask høy gjennomstrømming avbilding av levende celle signalnettverk trasé både i vitro og i vivo. Denne metoden kan utvides til en rekke bilde basert analyser og gaver som en følsom og reproduserbar tilnærming til både grunnleggende biologi og terapeutiske utvikling.

Introduction

Transformasjon av vekstfaktor β (TGF-β) er en viktig cytokin innblandet i menneskelig utvikling som signaliserer gjennom en heterodimeric består av type II og type I-reseptorer1. Binding til type II reseptor resulterer i rekruttering og fosforylering typen jeg reseptoren, som i sin tur phosphorylates nedstrøms Smad2/3 proteiner2,3. Dette aktivert Smad2/3 proteiner binde til Smad4, danner et kompleks som translocates til kjernen og regulerer genet transkripsjon4. Under homøostatisk forhold TGF-β/Smad er signalering strengt regulert; men i mange sykdommer, signalveien er deregulert og ofte overexpressed fører til progresjon av sykdommen5,6,7. Nyere studier har vist at cellulær respons til TGF-β er heterogene og subpopulasjoner av TGF-β/Smad aktive cellene er ansvarlige for biologisk funksjon i en tidsavhengige måte8,9. Vanlige mobilnettet analyse av TGF-β/Smad signalering innebærer bruk av fast endepunktet analyser som gir bare et øyeblikksbilde av cellulære aktiviteten og ofte quantitate gjennomsnittlig TGF-β/Smad effekt10. Disse metodene, men kan ikke nøyaktig representere molekylær oppførsel av TGF-β/Smad signalering i fysiologisk tilstand under sykdomsprogresjon. Image-basert analyse av lever celler fange dynamikken i mobilnettet og biologiske prosesser med både en romlig og timelige forståelse.

Målet var å utvikle en følsom høy gjennomstrømming metode for levende celle avbilding av TGF-β/Smad signalering bruker adenovirus-baserte reagenser. Her infisert vi menneskelig bryst kreft cellen linjen MDA-MB-231 med en adenovirus uttrykke Smad3 CAGA motiv bindende sekvensen og luciferase (Luc) eller Td-tomat (Td-Tom) reporter genet. Adenoviral reporter systemer er en rask og billig metode for plasmider introduksjon som kan resultere i en 100% infeksjon rate i kreftcelle linjer. Adenoviral reporter systemer har også vært anvendt på linjer som er vanskelige å transfect med konvensjonelle plasmider11. I denne protokollen vil vi beskrive en reproduserbar og noninvasive prosess for å oppnå levende celle avbildning av TGFβ/Smad-signalveien både i vivo og i vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble godkjent av University of Melbourne dyr etikk.

Merk: Sekvens, bygging og generasjon protokollen for det adenoviral vektorer pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP og pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom har vært beskrevet tidligere11,12, 13. Alle vektorer er kommersielt tilgjengelig.

1. virus Titer besluttsomhet bruker 50% vev-kultur smittsomme Dose (TCID50)

  1. Forberede 1 x 106 HEK293A celler i 10 mL av DMEM + 10% FBS media.
  2. Frø 100 µL av cellen suspensjon i hver brønn av en 96-brønns flat bunn celle kultur plate.
  3. Forberede 1 mL av en 1: 100 fortynning av virus lager i fullstendig medium. Legge til 11 µL av utvannet virus hver brønn i kolonne 1.
  4. Utføre føljetong 10 ganger fortynninger direkte i 96 godt platen ved å blande 11 µL av utvannet virus med 100 µL av cellen suspensjon inntil en endelig fortynning av 1 x1012 er nådd. Selv om celler er ikke-tilhenger på dette stadiet, antall celler mellom brønner forblir konstant.
  5. Pipetter 11 µL av hver fortynning i hver kolonne med den høyeste fortynning av 104. Erstatt pipette-spisser med hver fortynning begrense krysset av virus partikler.
  6. Legge til 11 µL av virusfri komplett kolonne 12 som en negativ kontroll.
  7. Inkuber plate for 7-10 dager på 37 ° C med 10% CO2.
  8. Bruker et mikroskop, score antall brønner i hver kolonne som viser tegn på cytopathic eller cytotoksisk. Vurdere en godt positiv hvis noen tegn til infeksjon.
  9. Beregn brøkdelen av positiv brønner for hver fortynning bruk Reed og Muench (1938) Statistisk metode14.
  10. Beregne proporsjonal avstand (PD) bruker: (A-50)/(A-B), der A er prosentandelen svaret ovenfor eller lik 50% og B er svaret som prosentandel under 50%.
  11. Beregne TCID50 bruker: 10X-PD, der X er fortynning gi svar mer enn 50%.
  12. Beregne viral titer bruker følgende: 0.69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL

2. adenovirus MOI besluttsomhet

  1. Frø 1.0-1,5 x 105 MDA-MB-231 celler med 500 μL av DMEM kultur medier som inneholder 5% FBS i hver brønn en 12 vel plate (35% celle confluency, 6 brønner totalt).
  2. Beregne volumet av Ad-CMV-Td-Tom lager kreves for 0, 250, 500, 2500 og 5000 MOI bruker følgende formel: MOI = (volum [μL] x PFU/μL) / antall celler. For Ad-CMV-Td-Tom med en titer 1 x 1010 (PFU/mL), volum av virusinfeksjon er nødvendig MOIs 0, 3,75, 7.5, 37,5 og 75 μL henholdsvis.
  3. Infisere cellene med beregnet volum av Ad-CMV-Td-Tom i delen 2.2 ved direkte pipettering viral lager i brønner med grundig blande.
  4. Plass platen i kuvøse på 37 ° C med 10% CO2 24 h.
  5. Fjern utskriftsmaterialet fra brønnene og umiddelbart løs cellene med 500 μL 10% formalin i 5 min.
  6. Sug opp formalin fra brønner og vask brønner med 500 μL PBS en gang.
  7. Stain cellekjernen med 500 μL Hoechst løsning for 5 min.
  8. Fjerne Hoechst løsningen og vask brønner med 500 μL PBS 3 ganger.
  9. Bilde Td-tomat protein og cellekjernen signal med 200 X forstørrelse på fluorescens mikroskop. Opphisse Td-tomat proteiner til 554 nm og Hoechst fargestoff på 352 nm.
  10. Analysere bilder ImageJ for å avgjøre arbeide MOI kreves for 100% infeksjon Td-tomat15.

3. dobbel-adenovirus signaltransduksjon i Live enkeltceller

  1. Frø 1.0-1,5 x 105 MDA-MB-231 celler med 500 μL av DMEM kultur medier som inneholder 5% FBS i hver brønn en 12 vel plate (35% celle confluency, 2 brønner totalt).
  2. Infisere celler med 75 μL Ad-CMV-GFP (titer = 5 x 109 PFU/mL) og 7,5 μL Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL) å få en 2500 MOI, som kan oppnå 100% infeksjon positivitet.
  3. Behandle celler med eller uten 0,25 μL TGF-β per brønn (10 mg/mL på lager, 5 ng/μL som den endelige konsentrasjonen) umiddelbart etter adenovirus infeksjon.
  4. Plass platen i kuvøse på 37 ° C med 10% CO2 24 h.
  5. Bildet lever celler med fase kontrast fluorescens mikroskop. Opphisse GFP på 470 nm og Td-tomat protein på 554 nm.
  6. Fastsette celler og flekken cellekjernen som beskrevet i trinn 1.6 - 1.9.
  7. Bilde Td-tomat protein og Hoechst flekken bruker fluorescens mikroskop. Opphisse Hoechst fargestoff på 352 nm.
  8. Bruker ImageJ, beregne prosentandelen av GFP og Td-tomat positiv celler15.

4. bor enkelt celle signalisering sårtilheling i analysen

  1. Frø 4-5 x 105 MDA-MB-231 celler med 1 mL av DMEM kultur medier som inneholder 5% FBS i hver brønn en 6 vel plate (50% celle confluency, 2 brønner totalt).
  2. Infisere cellene med 22,5 μL Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500).
  3. Plass platen i kuvøse på 37 ° C med 10% CO2 24 h.
  4. Ripe to kryssende streker på cellen laget i hver brønn ved hjelp av et P200 pipette tips.
  5. Fjerne den gamle mediet fra brønner og erstatte med 2 mL frisk 5% FBS media med eller uten 0,5 μL TGF-β per brønn (10 mg/mL på lager, 5 ng/μL som siste konsentrasjon).
  6. Plasser platen i kuvøse på 37 ° C med 10% CO2 i 5 min og ta bilder av valgte såret områder med 100 X forstørrelse på fase kontrast mikroskop.
  7. Plass platen i kuvøse på 37 ° C med 10% CO2 24 h.
  8. Ta bilder av såret nedleggelse på samme områder som før.
  9. Fastsette cellene, beis cellekjernen som beskrevet i trinn 1.6 - 1,9 og visualisere Td-tomat signal i såret området og ikke-sår området med 200 X forstørrelse på fluorescens mikroskop.
  10. Kvantifisere prosentandelen av Td-tomat positiv celler i såret og ikke-sår området bruker ImageJ programvare15.

5. in Vitro Luciferase analysen

  1. Forberede en celle suspensjon av 3-5 x 104 MDA-MB-231 celler i 1 mL av DMEM mediet som inneholder 5% FBS.
  2. Infisere celle hjuloppheng med 2,5 μL Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500).
  3. Frø av infiserte celler i en 96 plate også på 3000 celler/100 µL/godt.
  4. Plass platen i kuvøse på 37 ° C med 10% CO2 24 h.
  5. Fjerne gamle medier fra brønner og erstatte med 100 µL av fersk 5% FBS media med eller uten 0,1 μL TGF-β per brønn (1 mg/mL på lager, 1 ng/μL som den endelige konsentrasjonen) og tilstedeværelse eller fravær av 0,17 μL TGF-β hemmer per brønn (7 mg/mL på lager 12 ng/μL som siste konsentrasjon) (en roman TGF-β ligand felle protein, Chen et al., upublisert arbeid).
  6. Plass platen i kuvøse på 37 ° C med 10% CO2 24 h.
  7. Thaw ut luciferase analysen systemet underlaget og forberede 1 x celle kultur lysis reagens i dobbel destillert vann (DDW).
  8. Fjern medier fra 96 brønnene og lyse brønner med 50 μL av 1 x celle kultur-lyseringsbuffer på is en orbital shaker med mild agitasjon for 30 min.
  9. Overføre 30 μL lysate fra hver brønn til en ugjennomsiktig luciferase plate og la platen til varm til romtemperatur.
  10. På luminometer programvaren, kan du opprette en ny protokoll. Velg for 1 injektoren med målinger før og etter injeksjon. Angi mål før injeksjon på 1 s både forsinkelsen i måling og Integrasjon tid. For etter injeksjon måling, setter Injeksjon volumet til 40 µL med en forsinkelse i måling 1 s etter injeksjon og 5 s Integrering tid. Kontroller innstillingene ved å velge OK.
  11. Sett injektor røret til DDW og klikk injektor 1 under Prime innstillinger å rengjøre injektor røret før bruk. Neste fjerne injektor røret fra DDW og sted i luften etterfulgt av to ytterligere primtall av injektoren 1 å spyle alle løsning fra røret. Plass injektor røret i Firefly substrat og Prime to ganger for å forberede underlaget.
  12. Plasser ugjennomsiktig luciferase platen med prøvene i luminometer og velg Alternativer på programvare. Merk brønnene rundt og klikk Bruk. Trykk Start å måle luciferase signal.
  13. Når målene er fullført, fjern og skyll platen med vann. Gjenopprette gjenværende substrat inn i injektor røret ved å plassere røret i luft og Prime injektor 1 tilbake i firefly substrat rør. Sett injektor røret i DDW og utføre to ytterligere primtall å rengjøre injektor tube gjenværende substrat.

6. celle forberedelse til Live signalnettverk Imaging i Vivo

  1. 48 h før svulsten implantasjon, frø 2-3 x 106 MDA-MB-231 celler til 175 cm2 flasker (10 flasker totalt). Kultur celler i 20 mL DMEM mediet som inneholder 5% FBS ved 37 ° C, 10% CO2.
  2. 24 timer senere, legger 300 μL Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500) i hver kolbe. Holde celler i kultur for en annen 24 timer.
  3. På dagen for implantasjon, fjerne den gamle mediet og vask adenovirus infisert cellene gang med 20 mL PBS, pH 7.4. Legg 2 mL 0,05% trypsin-EDTA i flasken og riste flasken litt å tillate trypsin å dekke alle kolbe overflaten. Plass kolbe i å inkubator 37 ° C, 10% CO2 til 3 minutter.
  4. Slukke trypsin ved å legge til 8 mL FBS inneholder DMEM media i flasker. Overføre alle cellen suspensjoner til en reagens glassflaske.
  5. Beregne cellen ved hjelp av en hemocytometer og overføre 4.8 x 107 celler i to 50 ml sentrifuge rør.
  6. Sentrifuge cellene på 400 x g i 5 min på RT fjerne trypsin og resuspend celler i 720 mL av fersk FBS-DMEM media.
  7. Overføre av cellen suspensjon i et sterilt 5 mL rør og legge 160 μL Matrigel (10% totalt matrigel suspension).
  8. Holde celler på is før implantasjon.

7. Orthotopic implantasjon

  1. Veier 12 SCID mus og tilfeldig tildele mus i kontroll og behandling grupper (6 mus/gruppe).
  2. Utføre implantation i et sterilt bio-kabinett å opprettholde et sterilt miljø. Anaesthetize musen bruker 2,5-4,5% isoflurane med en oksygen flow rate 1 L/min. sted musen på en heten pute og dispensere en dråpe smøring øye ointment på begge øynene å unngå hornhinnen skade. Fastsette musen heten pute i supine posisjon mens opprettholde anestesi ved å plassere snute i en forpart koblet til isoflurane.
  3. Bekrefte suksessen med anestesi av mangel på reaksjon til tå knipe. Redusere isoflurane til en opprettholdelsen dose av 1.5-2.5% 1 L/min oksygen for påminnelsen av implantasjon.
  4. Rengjør huden fra fjerde brystvorten på begge sider til midtlinjen med bomullspinnen dyppet i 80% etanol.
  5. Finn 4th mammary fett puten gjennom palpasjon og klem fett puten å utsette videre vevet.
  6. Bland celle suspensjon godt av pipettering opp og ned. Forsiktig Sug opp 50 µL av cellen blandingen i en 27G insulin sprøyten og injisere i mammary fett puten på begge sider av musen.
  7. Bekrefte en vellykket injeksjon av følelse for hevelse av fett puten. Slipp fett puten forsiktig og plassere musen tilbake i buret.
  8. La merdene på den varme pad for minst 30 min å tillate mus å få bevissthet og deretter plassere merdene i holde rommet i 3 dager.

8. IVIS Imaging

  1. Åpne Bor bildet programvaren.
  2. Initialisere IVIS systemet ved å klikke Initialisere IVIS System på kontrollpanelet. Vent til temperaturen tegn blir grønt.
  3. Velg Luminescent Imaging modus på kontrollpanelet.
  4. Slå på isoflurane anestesi kammer og IVIS systemet.
  5. Anaesthetize mus ved hjelp av 2,5-4,5% isoflurane med 1 L/min oksygen. Når anaesthetized, kan du angi isoflurane 1.5-2.5% for vedlikehold. Injisere 150 mg/kg kroppsvekt av D-luciferin i mus ved intraperitoneal (IP) injeksjon.
  6. Øyeblikkelig overføre mus i IVIS systemet, plasseres på temperaturkontrollert tenkelig plattformen og plassere nesen i nesen kjegle.
  7. Klikk på Sekvens oppsett -knappen på kontrollpanelet og velg Medium Binning.
  8. Definere tenkelig eksponeringstid som følger: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, og 120 s. Start imaging ca 3 min etter luciferin injeksjon og fortsette å bilde til signalet begynner å slippe (normalt dette vil ta rundt 20 min).
  9. Fjerne mus fra IVIS samtidig isoflurane utføre handlinger gjennom en nesen kjegle og behandle mus med 50 µL PBS eller 50 µL TGF-β signalnettverk hemmer (50 μg/tumor) via intra-svulst injeksjon.
  10. Sett musene tilbake i buret og la dem på den varme pad for minst 30 min. Plass buret tilbake i holde rommet.
  11. Gjenta IVIS imaging prosedyren som beskrevet ovenfor dagen etter behandling.

9. dataanalyse

  1. Åpne lagrede filer i Levende programvare.
  2. Finn bildeinformasjonen bruker visningen | Bildeinformasjon.
  3. Velg bilder tatt på en lignende tidspunkt med samme eksponeringstid. Laster bilder som en gruppe.
  4. Uncheck boksen personlige i Bildet justere normalisere intensiteten.
  5. Velg Foton analysere intensiteten. Kvantifisere intensiteten av signalet ved å klikke Region av interesse (ROI) i Avkastningen verktøy.
  6. Dra ROI sirkelen til regionen bioluminescent signalet og klikk mål å erverve signal intensiteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Leve enkelt celle bildebehandling i vitro

Å nøyaktig vurdere aktivering av TGF-β/Smad signalering i enkeltceller bruker adenovirus basert reagenser, er det viktig å først bestemme den optimale mangfold av infeksjon (MOI) for hver celle linje. Den optimale MOI bestemmes når 100% av celler er positivt for adenoviral infeksjon uten stede cytopathic eller cytotoksiske effekter. For å fastslå dette, brukte vi constitutively aktive Ad-CMV-Td-Tom reporter som fungerte som en markør av positiv infeksjon. Andelen adenovirus infiserte celler ble økt på en MOI avhengige måte fra 0 til å 5000 MOI. På 2500 MOI observerte vi 100% Td-Tom uttrykk i MDA-MB-231 celler (figur 1A, 1B). Pixel intensitet/mobiltelefon også økt med MOI, gir bedre følsomhet og oppdagelsen av transcriptional (figur 1 c). Derfor ble en fungerende MOI på 2500 brukt til å utføre en dobbel infeksjon der celler var infisert med Ad-CMV-GFP (serveres som positive kontroll cellen infisert) og Ad-CAGA12-Td-Tom samtidig. Enkeltceller presentert varierende Td-Tom uttrykk som angir heterogene aktivisering TGF-β/Smad3 transkripsjon i celler i både live og fast celler. (Figur 2A, 2B). 100% av MDA-MB-231 celler presentert med GFP uttrykk mens bare rundt 26% av celler vises synlig TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet 24 timer etter TGF-β stimulering, sammenlignet med 0% positivitet uten TGF-β behandling (figur 2C). For å bruk adenovirus basert reagensen for å undersøke TGF-β/Smad3 transcriptional aktiviteten under biologiske prosesser, var MDA-MB-231 celler infisert med Ad-CAGA12-Td-Tom på 2500 MOI og utsatt for et sår helbredelse analysen. Infiserte MDA-MB-231 celler utstilt normal migration atferd og cellene behandlet med 5 ng/mL TGF-β viste forbedret såret nedleggelse sammenlignet med ikke-TGF-β behandlet celler (figur 3A). Spesielt om lag 62% celler i såret området presentert positiv TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet, som er betydelig høyere enn observert i ikke-sår området (32%) etter TGF-β behandling (figur3B). Slik godkjent adenovirus-baserte reagensene deres bruk for bildebehandling av TGF-β signalveien i live enkeltcelle i vitro.

Live TGF-β signalering tenkelig i vivo

Følsomheten til Ad-CAGA12- Luc reporteren var første testet i vitro svar TGF-β stimulering og tilstedeværelsen av en TGF-β inhibitor. Når infiserte MDA-MB-231 celler ble stimulert med 1 ng/mL TGF-β, luciferase reporter aktivitet økt 1,200-fold forhold til basale ubehandlet MDA-MB-231 nivåer. Dette svaret var bemerkelsesverdig blokkert av 12 µg/mL av TGF-β hemmer (figur 4A). Den Ad-CAGA12- Luc reagens ble senere testet i brystet tumor orthotopic implantasjon dyr modell. Både kontrollen og den TGF-β inhibitor behandlet grupper vist lignende luciferase reporter aktivitet før behandling. Men for kontrollgruppen endret luciferase signalet ikke etter PBS behandling, mens, mus behandlet med den TGF-β inhibitor viste rundt 3-fold signal reduksjon (figur 4B, 4 C). Samlet viser disse resultatene potensialet for live og sanntids overvåking av TGF-β signalnettverk aktivitet i vivo uten behov for dyr offer.

Figure 1
Figur 1. Fastsettelse av MOI av adenovirus-baserte reagensen. MDA-MB-231 celler var infisert med Ad-CMV-Td-Tom på ulike MOI og sådd i en 12 brønner plate. 24 h etter smitte, celler ble løst og kjernefysiske farget av Hoechst. (A) bilder ble tatt å visualisere Td-Tom positiv celler (rød) og kjernen (blå) og kvantifisert ved ImageJ. (B) prosentandel av Td-Tom positiv celler. (C) Td-Tom pixel intensitet/mobiltelefon normalisert bakgrunn. Disse tallene er representant for minst 3 uavhengige eksperimenter. Dataene som vises er triplicates ± SD. skala bar = 50 µm (200 X). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Enkelt celle bildebehandling for dobbel infeksjon. MDA-MB-231 celler var dobbelt infisert med Ad-CMV-GFP og Ad-CAGA12-Td-Tom på MOI (2500) og sådd i en 12 brønner plate. 24 timer etter infeksjon, celler ble behandlet med eller uten 5 ng/mL TGF-β. (A) 24 timer etter behandling, celler var live fotografert for å visualisere GFP positive (grønn) og Td-Tom positiv (rød) celler. Cellene ble deretter fast og kjernefysiske farget av Hoechst for kvantifisering. (B) bilder ble tatt for å visualisere GFP positive (grønn), Td-Tom positiv (rød) celler og kjernen (blå). (C) The GFP eller Td-Tom positiv celler kvantifisert ved ImageJ og prosentandelen av positiv celler ble beregnet. Disse tallene er representant for minst 3 uavhengige eksperimenter. Dataene som vises er triplicates ± SD. statistisk betydning ble bestemt av Student t-test (*** p ≤0.0001). Skala bar = 50 µm (200 X). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Levende celle TGF-β signalering fremmer celle migrasjon. MDA-MB-231 celler var infisert med Ad-CAGA12-Td-Tom på MOI (2500) og sådd på en 6 brønner tallerken. 24 h etter smitte, celler var riper bruker et P200 pipette tips til å lage et sår og media erstattet med eller uten 5 ng/mL TGF-β. Etter en annen 24 h, celler ble løst og kjernefysiske farget av Hoechst for visuell representasjon. (A) fase kontrast av såret nedleggelse, skala bar = 100 µm (100 X). (B) Td-Tom positiv (rød) celler og kjernen (blå). Skala bar = 50 µm (200 X) (C) Td-Tom positiv celler kvantifisert ved ImageJ og prosentandelen av positiv celler ble beregnet. Disse tallene er representant for minst 3 uavhengige eksperimenter. Dataene som vises er triplicates ± SD. statistisk betydning ble bestemt av Student t-test (*** p ≤0.0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Vivo bor TGF-β signalnettverk bildebehandling. (A) MDA-MB-231 celler var infisert med Ad-CAGA12- Luc og deretter sådd inn 96 brønner plate for 24 timer. Deretter ble celler behandlet med eller uten 1 ng/mL TGF-β i tilstedeværelse eller fravær av 12 µg/mL TGF-β hemmer over natten. Luciferase aktiviteten ble målt basert på hele cellen lysate. Luciferase aktiviteter ble presentert som fold av induksjon normalisert ingen behandling-kontroll. Dataene som vises er triplicates ± SD. (B) MDA-MB-231 celler var infisert med Ad-CAGA12- Luc 24 timer før implantasjon. Cellene ble implantert i mammary fett pad på begge sider av SCID mus. 72 h senere, IVIS imaging ble utført før og etter 24 h behandling (PBS for kontrollgruppen) og 50 µg/svulst TGF-β inhibitor for behandling gruppen. (C) Foton flux ble kvantifisert ved bor programvare. Dataene som vises er gruppene behandling (n = 12) ± SD. statistisk betydning ble bestemt av Student t-test (** p ≤0.01, *** p ≤0.0001). p/s refererer til fotoner/s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utviklet en teknikk for å muliggjøre sanntids avbilding av TGF-β/Smad3 signalering i live enkeltceller. Bruker denne romanen metoden, har vi tidligere identifisert en sub-populasjon av celler med dynamisk TGF-β/Smad3 transcriptional aktivitet som ble tilknyttet forbedret invasjon og overføring8. Denne metoden forbedrer på tradisjonelle analyser for TGF-β signalnettverk, som vestlige blots av Smad3 fosforylering og TGF-β målrettet genuttrykk, ved å fange heterogenitet av TGF-β/Smad3 signalering i befolkningen svulst og markere den betydningen av enkeltcelle biologi. Dessuten alternative metoder enkeltcelle Imaging som kjernefysisk translokasjon kan være tidkrevende og kostbar hvis utført i live celler og kan ikke alltid oversette til genet transkripsjon16,17. Mens disse metodene er viktig å undersøke oppstrøms veier av signaltransduksjon, gir adenovirus reporter systemet et unikt perspektiv på TGF-β/Smad3 signalering i enkeltceller i forhold til biologisk funksjon.

Betydelig, vår metode gir en følsom og reproduserbar metode i vivo deteksjon av TGF-β/Smad3 signalveien i sanntid under svulst progresjon og behandling. Ligner tradisjonelle stabil luciferase i vivo bildebehandling, oppdagelsen av TGF-β/Smad3 signalering i musen er avhengig av antall celler og nivå av arrangøren aktivitet18. Mens subkutant vev gir lite forstyrrelser for analyse, vil økt dybdeskarphet celler redusere følsomheten av. Det er mulig å utvide metoden for bruk i andre organer, lunge, bein og andre kreftformer; men anbefales signalet optimalisering eller ex vivo imaging å oppnå følsomheten kreves for kreft modellen av interesse.

En ekstra fordel ved bruk av adenovirus reporter systemet er at programmet er sannsynlig å utvide til analyse av flere signalveier samtidig i lever celler. I figur 2Aviste vi at MDA-MB-231 celler kan være transduced med 2 separate adenovirus vektorer, CMV-GFP og CAGA-TOM. Dual-infeksjon systemet kan utvides ytterligere rapportere to forskjellige signalveier via både fluorescens reporter proteiner og luciferase journalister (med Firefly og Guassia luciferase reporter protein). Våre lab har oppnådd samtidige signalene med BMP/Smad1 og TGF-β/Smad3 signalveier i en rekke live kreftcelle linjer (data ikke vist).

Adenovirus reporter systemer gir en enkel og praktisk metode for levende celle avbilding av TGF-β/Smad signalveien både i vitro og i vivo. Dette systemet har klare fordeler fremfor andre brukte reporter systemer. Først er adenovirus vektorer rapportert å ha blant høyeste viral signaltransduksjon effekt, noe som gjør dem til en optimal system for linjer som er vanskelige å transduce19,20,21,22. I tillegg med gjeldende fremskritt i viral teknologier, kan 'gutless' adenovirus vektorer genereres ved å fjerne mesteparten av viral genomet muliggjør økt eksogene DNA kapasitet23. I forhold til ikke-viral leveringssystemer representerer adenovirus vektorer en kostnadseffektiv, rask og enkel søknad for cellen signaltransduksjon som resulterer i større levering effektivitet19,20,21 ,22.

Denne protokollen bruker en andre generasjon adenovirus uttrykk system, som er replikering-inhabil i pattedyrceller som ikke uttrykke E1a og E1b proteiner, minimere biosikkerhet risiko24. Men til tross for disse forbedrede biosikkerhet funksjoner, adenovirus partikler kan fortsatt transduce primære menneskelige celler med høy effekt25,26. Amerikanske biosikkerhet nivå 2 og kontroll av adenoviral vektorer anbefales når håndtering og avhending av adenovirus forurenset utstyr. Store forsterkning av adenovirus i HEK293A celler kan føre en sjelden generasjon replikering kompetente "wild-type" adenovirus27. PCR screening skal utføres for å identifisere vill-type forurensning27.

Replikering-inkompetente adenovirus vektorer er forbigående i uttrykk og integreres ikke med verten DNA20,21. Det anbefales at eksperimentator identifisere stabiliteten i uttrykk for deres reporter protein ved adenovirus reporter systemet for å bekrefte gyldigheten av langsiktig eksperimenter. Uttrykket skrivende adenovirus vektor i en celle er proporsjonal med divisjon tidspunktet for celle- og viral MOI. For å sikre reproduserbar resultater, er det avgjørende at viral titer bestemmes nøyaktig for hver viral kladd. I tillegg svært store mengder av adenovirus kan medføre cytotoksiske eller cytopathic effekter og det er viktig at en optimal MOI bestemmes empirisk for hver celle foret brukes til å sikre de beste resultatene. Videre kan i vivo bruk av adenovirus vektorer indusere immunreaksjoner; hvor immunforsvaret er ikke primære observasjon av eksperimentet anbefales immun kompromittert dyr20,21. Ekstra kvalitetskontroll er nødvendig når du bruker adenoviral vektorer til målet immunreaksjoner, om bruk av adenovirus er validert oppnå vaksinen terapi28,29.

Adenovirus reporter systemet kan brukes på et bredt spekter av primære og kultivert cellelinjer dele og ikke-delte natur20,22. Bruke adenovirus reporter systemet, vi har oppnådd 100% infeksjon priser i en rekke kreftcelle linjer inkludert hjernen, bryst, tykk som godt primære musen embryologiske Fibroblast (MEF) og hjørnetann nyre Epithelial (MDCK) celler. I tillegg kan adenoviral vektorer bli ytterligere endret for å øke affinitet for celle-type spesifikke reseptorer, gir forbedret orgel målretting og effekt for signaltransduksjon30,31.

Programmer med denne metoden kan utvides til andre signalveier og celle verter. De viktigste fordelene ved adenoviral reporter systemet inkluderer billige, høy signaltransduksjon effekt, eksperimentelle hurtigoppsett og mangel på integrasjon med verten DNA21,32. Denne metoden kan brukes til mange gjeldende analyser og i vivo modeller, inkludert i evalueringen av nye målrettede therapeutics33. Vi håper at bruk av denne teknikken vil forbedre vår forståelse av forholdet mellom signalnettverk trasé og biologiske prosesser fører til nye biologiske funn og utvikling av nye terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) til H-JZ. TMBW er en mottaker av en Australia Postgraduate Award fra den australske regjeringen og Ann Henderson påfylling stipend fra australske Rotary helse i partner med roterende av Templestowe og Dine for en kur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
  2. Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
  3. Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
  4. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
  5. Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
  6. Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
  7. Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
  8. Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
  9. Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
  10. Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
  11. Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
  12. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
  13. Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
  14. Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  16. Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
  17. Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
  18. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
  19. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  20. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
  21. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
  22. Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
  23. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
  24. Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
  25. Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
  26. MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
  27. Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
  28. Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
  29. de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
  30. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
  31. Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
  32. Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
  33. Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).

Tags

Kreftforskning problemet 137 TGF-β live celle bildebehandling adenovirus celle signalisere bryst kreft Smad3 transcriptional aktivisering
Live celle avbildning av den TGF-β/Smad3 signalnettverk Pathway <em>In Vitro</em> og <em>i Vivo</em> bruker en Adenovirus Reporter System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., … More

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter