In Vivo Photolabeling cellen in de dikke darm te beoordelen van trekkende potentieel van hematopoietische cellen in neonatale muizen
Summary
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een photolabeling benadering bij pasgeboren muizen te specifiek immune cellen die van de dubbelpunt te naar extra intestinale sites emigreren te identificeren. Deze strategie zal worden nuttig zijn te onderzoeken van host-microbiome interacties in vroege leven.
Abstract
Darmen bacteriële Gemeenschappen zijn gevestigd vroeg in het leven en immuun cel ontwikkeling en functie beïnvloeden. De neonatale microbiota is gevoelig voor talrijke externe invloeden waaronder antibiotica gebruik en dieet, dat de gevolgen van de gevoeligheid voor auto-immuunziekten en inflammatoire ziekten. Stoornissen zoals Inflammatory Bowel Disease (IBD) worden gekenmerkt door een massale toevloed van immune cellen aan de darmen. Echter, kunnen immuuncellen geconditioneerd door de microbiota bovendien emigreren uit de darmen te beïnvloeden immuunresponsen bij extra-intestinale plaatsen. Er is dus een noodzaak om te identificeren en te karakteriseren cellen microbiële berichten van de darmen naar distale sites kunnen uitvoeren. Hier beschrijven we een methode om label cellen in de dikke darm van pasgeboren muizen in vivo waarmee hun identificatie op extra-intestinale sites na de migratie.
Introduction
De zoogdieren gastro-intestinale tractus havens honderden soorten bacteriën die aanwezig zijn in een symbiotische relatie met de host1. De immune cellen aanwezig in het lokale milieu dwingen een vreedzame coëxistentie met deze microben en stellen een beschermende barrière tegen pathogeen invasies. Dus, bi-directionele interacties tussen de immuun cellen en de microbiota zijn cruciaal voor het stellen van een commensale Gemeenschap die opleiden van het immuunsysteem van de gastheer en de drempel voor Immuunreactiviteit ingesteld voor ziekteverwekkers. Wijzigingen in de microbiële samenstelling, of dysbiosis, kan de immuun homeostase te verstoren en erover regelgevende circuits die bedwingen intestinale ontstekingen leiden tot immuun-gemedieerde aandoeningen zoals Type 1 Diabetes en IBD2,3 .
De periode onmiddellijk na de geboorte is een unieke developmental venster waarin de intestinale microbiële gemeenschappen beginnen om tegelijkertijd het immuunsysteem rijpt4. De postnatale microbiota is niet stabiel, met verschuivingen in de samenstelling van de Gemeenschap die van nature voorkomen en vaak5. De immune cellen die met de microbiota samenwerken bevinden zich in twee verschillende anatomische locaties in de darm – de lamina propria en het intestinaal epitheel6. Vele soorten immuuncellen zijn aanwezig in de darm, inclusief lymfocyten (zoals T-cellen, B-cellen en aangeboren lymfoïde cellen) alsmede myeloïde cellen (waaronder dendritische cellen, monocyten en macrofagen). Deze cellen, ook bekend als hematopoietische cellen, voeren een veelheid aan functies die behouden de intestinale barrière en homeostase te handhaven.
Naast hun regelgevende taken op intestinale sites, kunnen immune cellen van de mucosa ook overgaan tot microbiële berichten naar de extra-intestinale sites te reguleren van systemische immuniteit7,8,9. Dit is een gebied van groeiend belang van onderzoek en wijst op de noodzaak van methoden voor het identificeren van immune cellen die uit intestinale weefsels migreren om sonde van hun functie. Het protocol hier gemeld maakt gebruik van een commercieel beschikbare muismodel waarin een photoconvertible TL proteïne label cellen is benut. PhAMweggesneden muizen express overal een groen fluorescerend Dendra2 proteïne dat onomkeerbaar is overgestapt op rode fluorescentie na activatie door ultraviolet licht (UV)-10. Met behulp van een fiber optic canule om licht van 405 nm in de dikke darm van pasgeboren muizen, we laten zien dat photoconverted hematopoietische cellen, die is ontstaan in of doorgevoerd door de dikke darm kunnen worden gevonden in de milt.
Protocol
Representative Results
Discussion
De identificatie en karakterisering van cellen die communiceren met en worden beïnvloed door de microbiota in de dikke darm zijn belangrijk en moeten vergemakkelijken begrip van hoe de informatie van de mucosal communicatie is doorgegeven aan de rest van het lichaam. Een methode voor het bestuderen van de darm-gerelateerde cel migratie vereist het isolement van de darm-geassocieerde cellen, gevolgd door een adoptief overdracht naar geadresseerden muizen om te bepalen hun weefsel-homing patronen en12</s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nitya Jain werd gesteund door een NIH/NIAID Career Transition Award 1K22AI116661-01.
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
