في فيفو فوتولابيلينج الخلايا في القولون لتقييم إمكانية الهجرة من الخلايا المكونة للدم في الفئران حديثي الولادة
Summary
البروتوكول هو موضح هنا تستخدم نهجاً فوتولابيلينج في الفئران حديثي الولادة على وجه الخصوص تحديد الخلايا المناعية التي يهاجر من القولون إلى مواقع خارج المعوية. سوف تكون هذه الاستراتيجية مفيدة لدراسة التفاعلات بين المضيف-ميكروبيومي في وقت مبكر من الحياة.
Abstract
المجتمعات البكتيرية المعوية تقام في بداية الحياة والتأثير على تنمية الخلايا المناعية والدالة. الحجمية الولدان عرضه للتأثيرات الخارجية العديدة بما في ذلك استخدام المضادات الحيوية والنظام الغذائي، مما يؤثر على قابلية لأمراض المناعة الذاتية والالتهابات. اضطرابات مثل أمراض الأمعاء الملتهبة (الأمريكتين) تتميز بتدفق إعداد كبيرة من الخلايا المناعية للامعاء. ومع ذلك، قد بالإضافة إلى ذلك الهجرة الخلايا المناعية مكيفة حسب الحجمية الخروج من الأمعاء للتأثير على الاستجابات المناعية في مواقع خارج المعوية. وبالتالي، هناك حاجة تحديد وتوصيف الخلايا التي قد تحمل رسائل للميكروبات من الأمعاء إلى المواقع البعيدة. هنا، يمكننا وصف طريقة لتسمية الخلايا في القولون من الفئران حديثي الولادة في فيفو التي تمكن من التعرف عليهم في مواقع خارج المعوية بعد الهجرة.
Introduction
الجهاز الهضمي الثدييات تؤوي مئات الأنواع من البكتيريا التي توجد في علاقة تكافلية مع المضيف1. فرض تعايش سلمي مع هذه الميكروبات الخلايا المناعية الموجودة في الوسط المحلي وإقامة حاجز وقائي ضد الغزوات الممرض. وهكذا، التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا المناعية والحجمية ذات الأهمية الحاسمة لإقامة مجتمع commensal أن يثقف المضيف الجهاز المناعي ويقوم بتعيين عتبة مفاعليه المناعي لمسببات الأمراض. التغييرات في العوامل الجرثومية يمكن تكوينها، أو dysbiosis، تخل بالتوازن المناعي والتشويش الدوائر التنظيمية التي تقيد الالتهابات المعوية مما يؤدي إلى الأمراض بوساطة جهاز المناعة مثل داء السكري من النوع 1 وبنك التنمية بين الأمريكتين2،3 .
الفترة مباشرة بعد الولادة هو نافذة التنموية فريدة خلالها المجتمعات الميكروبية الأمعاء تبدأ في إنشاء نظام المناعة في نفس الوقت ينضج4. الحجمية بعد الولادة ليست مستقرة، مع التحولات في تركيبة المجتمع التي تحدث طبيعيا وكثيراً ما5. الخلايا المناعية التي تتفاعل مع الحجمية الموجودة في هذين الموقعين تشريحية متميزة في الأمعاء- بروبريا الصفيحة و ظهارة الأمعاء6. توجد أنواع عديدة من الخلايا المناعية في الأمعاء، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية (مثل خلايا T وخلايا ب والخلايا اللمفاوية الفطرية) فضلا عن الخلايا النقوي (التي تتضمن الخلايا الجذعية، وحيدات، والضامة). هذه الخلايا، تعرف أيضا باسم الخلايا المكونة للدم، القيام بالعديد من الوظائف التي تحافظ على الحاجز المعوي، والحفاظ على التوازن.
بالإضافة إلى مهامها التنظيمية في مواقع المعوية، خلايا المناعة في الغشاء المخاطي قد تحمل أيضا رسائل الميكروبية إلى مواقع خارج المعوية لتنظيم الحصانة الشاملة7،،من89. هذا هو مجال يحظى باهتمام متزايد من البحوث ويسلط الضوء على الحاجة إلى أساليب لتحديد الخلايا المناعية التي تهاجر من الأنسجة المعوية من أجل التحقيق في وظيفتها. ويستخدم البروتوكول ذكرت هنا نموذجا ماوس متاحة تجارياً التي يتم استغلالها بروتين فلوري فوتوكونفيرتيبلي لتسمية الخلايا. أوبيكويتوسلي express الفئراناقتطعت أم بروتين Dendra2 فلورية خضراء التي يتم تبديل لا رجعة فيه إلى الأسفار حمراء عند التنشيط بالضوء من الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية)10. استخدام قنية ألياف بصرية لتقديم 405 نانومتر الضوء في القولون الفئران حديثي الولادة، وعلينا أن نبرهن أن يمكن العثور على الخلايا المكونة للدم فوتوكونفيرتيد، التي يكون منشؤها أو عبور القولون في الطحال.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديد وتوصيف الخلايا التي تتفاعل مع وتتأثر الحجمية في القولون مهمة وينبغي أن تيسر فهم كيف يتم ترحيل المعلومات من المكروية المخاطية إلى بقية الجسم. ويتطلب أسلوب واحد لدراسة الهجرة الخلية المتصلة بالقناة الهضمية عزل الخلايا المرتبطة بالقناة الهضمية متبوعاً نقل التبني في الفئران المستفيد?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
جاين نيتيا أيده “جائزة الانتقال الوظيفي” المعاهد الوطنية للصحة/نييد 1K22AI116661-01.
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
