In Vivo Photolabeling av cellerna i tjocktarmen att bedöma flyttande potentialen för hematopoetiska celler hos neonatala möss
Summary
Protokollet beskrivs här använder tredjeparts ett photolabeling tillvägagångssätt i nyfödda möss att specifikt identifiera immunceller som emigrerar från tjocktarmen till extra intestinal platser. Denna strategi kommer att vara användbart att studera värd-mikrobiomet interaktioner tidigt i livet.
Abstract
Enteriska bakteriesamhällen etableras tidigt i livet och påverka immunceller utveckling och funktion. Den neonatala bakterieflora är mottagliga för många yttre påverkan inklusive antibiotika användning och kost, vilket påverkar mottagligheten för autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar. Störningar såsom inflammatorisk tarmsjukdom sjukdom (IBD) kännetecknas av en massiv tillströmning av immunceller till tarmen. Immunceller som betingas av bakterieflora kan dock dessutom utvandra ur tarmarna att påverka immunsvaret på extra intestinal platser. Således finns det ett behov av att identifiera och karaktärisera celler som kan bära mikrobiell meddelanden från tarmarna till distala platser. Här, beskriver vi en metod att etiketten cellerna i tjocktarmen av nyfödda möss i vivo som gör deras identifiering på extra intestinal platser efter migreringen.
Introduction
Däggdjur magtarmkanalen hamnar hundratals arter av bakterier som finns i ett symbiotiskt förhållande med värd1. Immuncellerna finns i den lokala miljön upprätthålla en fredlig samexistens med dessa mikrober och upprätta en skyddande barriär mot patogener invasioner. Dubbelriktad interaktioner mellan immuncellerna och bakterieflora är således avgörande att inrätta en kommensaler gemenskap som utbildar värd immunsystemet och anger tröskelvärdet för immun reaktivitet till patogener. Förändringar i mikrobiell komposition eller dysbios, kan störa immun homeostas och stör reglerande kretsar som hindrar intestinala inflammationer leder till immunmedierade sjukdomar som typ 1 Diabetes och IBD2,3 .
Perioden omedelbart efter födseln är en unik utvecklingsmässiga fönster under vilken de intestinala mikrobiella samhällena börjar upprätta samtidigt immunförsvaret mognar4. Den postnatala bakterieflora är inte stabil, med förändringar i gemenskapens sammansättning förekommer naturligt och ofta5. De immunceller som samverkar med bakterieflora bosatta i två skilda anatomiska platser i tarmen – i lamina propria och intestinal epitel6. Många typer av immunceller är närvarande i tarmen, inklusive lymfocyter (som T-celler, B-celler och medfödda lymfoida celler) samt myeloida celler (som inkluderar dendritiska celler, monocyter och makrofager). Dessa celler, även känd som hematopoetiska celler, utföra en mängd funktioner som bevarar tarmbarriären och upprätthålla homeostas.
Förutom deras reglerande funktioner på intestinal platser, kan immunceller i slemhinnan också bära mikrobiell meddelanden till extra intestinal platser att reglera systemisk immunitet7,8,9. Detta är ett område av växande forskningsintresse och belyser behovet av metoder för att identifiera immunceller som migrerar av intestinal vävnader för att undersöka deras funktion. Det protokoll som redovisas här använder tredjeparts en kommersiellt tillgänglig musmodell där en photoconvertible fluorescerande protein utnyttjas till etikett celler. PhAMcensurerade möss express ubiquitously ett grönt fluorescerande Dendra2 protein som är oåterkalleligt bytte till röd fluorescens vid aktivering av ultraviolett (UV) ljus10. Använda en fiber optic kanyl för att leverera 405 nm ljus in i tjocktarmen av nyfödda möss, visar vi att photoconverted hematopoetiska celler, som har sitt ursprung i eller transiterat genom tjocktarmen kan hittas i mjälten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifiering och karakterisering av celler som interagerar med och påverkas av bakterieflora i tjocktarmen är viktiga och bör underlätta förståelse av hur information från de slemhinnor mikromiljö vidarebefordras till resten av kroppen. En metod för att studera gut-relaterade cellmigration kräver isolering av gut-associerade celler som följde av en överföring in i mottagarens möss att avgöra deras vävnad-homing mönster och funktion12,13. Detta t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nitya Jain stöddes av en NIH/NIAID karriär övergång Award 1K22AI116661-01.
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
